二氢吡啶类钙拮抗剂的分析

1、二氢吡啶类钙拮抗剂的分析二氢吡啶类钙拮抗剂的分析药学院药物分析教研室药学院药物分析教研室【大纲要求【大纲要求】1 1、掌握二氢吡啶类钙拮抗剂类代表药物的、掌握二氢吡啶类钙拮抗剂类代表药物的体内过程体内过程2 2、熟悉二氢吡啶类钙拮抗剂类代表药物的、熟悉二氢吡啶类钙拮抗剂类代表药物的体内分析方法体内分析方法HNH3CCH3OH3CONO2OOCH3硝苯地平硝苯地平HNH3CCH3OH3COOOCH3NO2尼群地平尼群地平HNH3CCH3OH3COOONO2O尼莫地平尼莫地平HNH3COH3COOOCH3ClONH2氨氯地平氨氯地平主要代表性药物主要代表性药物主要的理化性质主要的理化性质较强的紫外

2、吸收特性，没有荧光特性较强的紫外吸收特性，没有荧光特性一般显中性，含有一般显中性，含有N N原子的显弱碱性原子的显弱碱性不稳定性，见光易分解不稳定性，见光易分解光学特性光学特性体内过程体内过程口腹易吸收、半衰期短、达峰时间较快口腹易吸收、半衰期短、达峰时间较快血浆蛋白结合率高血浆蛋白结合率高一般经肝脏代谢，代谢产物一般没有活性一般经肝脏代谢，代谢产物一般没有活性含量分析方法含量分析方法同位素标记法同位素标记法荧光分析法荧光分析法气相色谱法气相色谱法液相色谱法液相色谱法色谱和质谱联用法色谱和质谱联用法 样品的制备：样品的制备：往往采用简单的液液往往采用简单的液液萃取法进行，萃取溶剂多为苯、乙酸乙

3、萃取法进行，萃取溶剂多为苯、乙酸乙酯和氯仿等，取萃取后的有机层，挥干酯和氯仿等，取萃取后的有机层，挥干用流动相溶解后直接进样分析。用流动相溶解后直接进样分析。荧光测定法荧光测定法硝苯地平三氯化钛邻苯二甲醛荧光物质硝苯地平三氯化钛邻苯二甲醛荧光物质用乙酸乙酯进行液液萃取（用乙酸乙酯进行液液萃取（pH=7)，测定硝苯地平，测定硝苯地平用氯仿进行液液萃取（用氯仿进行液液萃取（pH=2)，测定硝苯地平的代谢产物，测定硝苯地平的代谢产物气相色谱分析气相色谱分析色谱柱：填充柱或毛细管柱色谱柱：填充柱或毛细管柱 OV-1 OV-17OV-1 OV-17柱温：柱温：225225270270检测器：电子捕获检测

4、器检测器：电子捕获检测器 ECDECD人血浆中尼群地平的人血浆中尼群地平的GCGC法测定法测定色谱条件：色谱条件：DB-1DB-1毛细管柱（毛细管柱（25 m25 m 0.328 mm, 0.328 mm, I.D., 0.5 m)I.D., 0.5 m)载气：高纯氮气载气：高纯氮气检测器检测器: ECD: ECD进样温度：进样温度：260 260 检测温度：检测温度：300 300 升温方式：程序升温升温方式：程序升温 255 255 （6.2 min)6.2 min)270 270 （5min5min）分流进样：分流进样：4040：1 14/min4/min 样品的前处理：样品的前处理：取

5、内标，加血样，混取内标，加血样，混合后加入合后加入1mol/mL1mol/mL的的NaOH0.5mlNaOH0.5ml，混合，混合，加入乙醚加入乙醚- -环己烷（环己烷（1 1：1 1），窝旋，离），窝旋，离心，取有机相用氮气流吹干，残渣用甲心，取有机相用氮气流吹干，残渣用甲醇溶解后进样分析。醇溶解后进样分析。人血浆中尼莫地平的毛细管气相人血浆中尼莫地平的毛细管气相色谱色谱ECDECD检测及药代动力学检测及药代动力学 样品制备：样品制备：加入加入1g/ml1g/ml的尼群地平，的尼群地平，再加入再加入1mol/lNaOH 0.5ml1mol/lNaOH 0.5ml，混匀后，用乙，混匀后，用乙酸

6、乙酯正己烷（酸乙酯正己烷（1 1：1 1）萃取，）萃取，4000 rpm4000 rpm离心，取有机相吹干后用甲醇溶解后进样离心，取有机相吹干后用甲醇溶解后进样分析分析。色谱条件：色谱条件：OV-101OV-101毛细管柱（毛细管柱（25 m25 m 0.2 mm, 0.2 mm, I.D., 0.5 mI.D., 0.5 m) )载气：高纯氮气载气：高纯氮气检测器检测器: ECD: ECD进样温度：进样温度：260 260 气化室温度：气化室温度：270270检测温度：检测温度：300 300 升温方式：恒温洗脱升温方式：恒温洗脱分流进样：分流进样：3333：1 12.02.025.025.

7、0100.0100.0回收率回收率 日间日间 日内日内82.382.388.488.489.289.28.58.57.07.01.11.18.88.87.57.52.92.9高效液相色谱法高效液相色谱法一般进行的是反相液相色谱法一般进行的是反相液相色谱法一般使用紫外检测器或电化学检测器一般使用紫外检测器或电化学检测器一般多选用含有缓冲液的甲醇或乙腈一般多选用含有缓冲液的甲醇或乙腈为流动相为流动相可选用同类药物或安定类药物为内标可选用同类药物或安定类药物为内标RP-HPLCRP-HPLC法测定血浆中的硝苯地平法测定血浆中的硝苯地平 样品制备样品制备 取待测血浆取待测血浆600l600l，置于，置

8、于10ml10ml具具塞离心管中，加地西泮内标物溶液（塞离心管中，加地西泮内标物溶液（300ng/ml300ng/ml）200ul,200ul,氨水氨水120l,120l,涡旋振荡涡旋振荡1min,1min,再加入提取溶剂再加入提取溶剂 无水乙醚正己烷（无水乙醚正己烷（3 3：1 1） 4ml 4ml，涡旋振荡，涡旋振荡20min20min，离心（，离心（3000r/min3000r/min）10min10min，置，置-20-20C C的冰箱的冰箱中冷冻中冷冻2h2h，上层有机相转移至另一离心管中，于，上层有机相转移至另一离心管中，于5050C C水浴中用氮气吹干，残渣加水浴中用氮气吹干，残

9、渣加5050乙腈乙腈200l, 200l, 涡旋混合、离心（涡旋混合、离心（1500r/min1500r/min）10min10min，取，取15l15l进进样（低浓度则进样样（低浓度则进样30l30l）。）。色谱条件色谱条件 色谱柱为色谱柱为Luna C18(250Luna C18(250* *4.6mm,5um)4.6mm,5um)；保护柱为；保护柱为AlltechAlltech C18(30C18(30* *2mm,40um)2mm,40um)。流动相为乙腈水二乙胺磷酸（。流动相为乙腈水二乙胺磷酸（5151：4949：0.120.12：0.100.10，V/VV/V），流速），流速1.2

10、ml/min1.2ml/min。柱温。柱温4545C C。紫外监测器，波长。紫外监测器，波长238nm238nm，进样量，进样量151530l30l。RP-HPLCRP-HPLC法测定尼群地平法测定尼群地平样品制备样品制备 避光操作。取体液避光操作。取体液1l1l或组织匀浆或组织匀浆4ml4ml，置置15ml15ml具塞离心管中，精密加入地尔硫卓内标物溶液具塞离心管中，精密加入地尔硫卓内标物溶液（1g/L1g/L甲醇）甲醇）10.2ml10.2ml，加，加50mmol/L50mmol/L磷酸盐缓冲溶液磷酸盐缓冲溶液（pH9.8pH9.8）1ml,1ml,摇匀，加环己烷异丙醇（摇匀，加环己烷异丙

11、醇（96.596.5：3.53.5，V/VV/V）5ml5ml提取，离心（提取，离心（4000r/min4000r/min）15min,15min,取有机相于取有机相于水浴中用氮气吹干，残渣溶于水浴中用氮气吹干，残渣溶于100l100l流动相，吸取流动相，吸取10l10l进样分析。进样分析。色谱条件色谱条件 色谱柱为色谱柱为YWG C18(150YWG C18(150* *4.6mm,5m)4.6mm,5m)。流动相。流动相为甲醇：为甲醇：50 mmol50 mmol/L/L磷酸盐缓冲溶液磷酸盐缓冲溶液7070：3030，V/VV/V），磷），磷酸调酸调pHpH至至6.86.8；流速；流速1.

12、0ml/min1.0ml/min。柱温：室温。紫外监测。柱温：室温。紫外监测器，波长器，波长236nm236nm；进样量；进样量10l10l。 HPLCHPLC电化学检测法测定血浆或血清中尼电化学检测法测定血浆或血清中尼卡地平及其代谢产物卡地平及其代谢产物 样品制备样品制备 取待测血浆样品取待测血浆样品200l200l，加入，加入pH1.0pH1.0的的TrisTris缓冲液和内标物布替林，用甲基叔丁基醚提取，缓冲液和内标物布替林，用甲基叔丁基醚提取，离心后分离有机相，取离心后分离有机相，取100l100l进样。进样。色谱条件色谱条件 色谱柱为色谱柱为S5SCXS5SCX硅胶柱（硅胶柱（125

13、x5.0 mm125x5.0 mm，5m5m）。流动相：甲醇，含）。流动相：甲醇，含20 mmol20 mmol/L/L高氯酸铵。流高氯酸铵。流速：速：2.0ml/min2.0ml/min。检测：电化学检测器，玻碳电极为。检测：电化学检测器，玻碳电极为工作电极，工作电极，Ag/AgClAg/AgCl为参比电极，工作电位为参比电极，工作电位+1.1V+1.1V。液相色谱质谱质谱联用法测定人血液相色谱质谱质谱联用法测定人血浆中的氨氯地平浆中的氨氯地平 样品制备样品制备 在暗室中取血浆在暗室中取血浆1.0 ml1.0 ml置置10 ml10 ml具塞试管中，依次加具塞试管中，依次加入流动相入流动相1

14、00l,100l,内标物溶液（内标物溶液（4 4羟基普罗帕酮溶液羟基普罗帕酮溶液80ng/ml80ng/ml，用流动相溶解）用流动相溶解）100l100l，1mol/LnaOH1mol/LnaOH溶液溶液100 ul100 ul, ,涡旋涡旋30 s30 s。加。加乙醚二氯甲烷（乙醚二氯甲烷（2 2：1 1）3 ml3 ml提取，往复振荡提取，往复振荡10 min10 min，离心，离心5 5 minmin，分取有机相于，分取有机相于4040C C空气流中吹干。残留物加空气流中吹干。残留物加100l100l流动相流动相溶解，取溶解，取20l20l进样。进样。色谱条件色谱条件 色谱柱：色谱柱：Z

15、orbaxZorbax XDB C8 XDB C8柱（柱（150 mm150 mm* *4.6 mm ID,5 4.6 mm ID,5 mm）。流动相：乙腈水甲酸（）。流动相：乙腈水甲酸（7575：3535：1 1），流速：），流速：0.4ml/min0.4ml/min。柱温为。柱温为2020C C。质谱条件质谱条件 离子源为离子源为ESIESI源，源电压源，源电压4.5kV4.5kV；加热毛细；加热毛细管温度管温度150150C C；鞘气为氨气，流速；鞘气为氨气，流速621kPa621kPa；辅助气（；辅助气（N2N2）流速流速23au;23au;碰撞气（碰撞气（ArAr）压力）压力1.9Pa1.9Pa。碰撞诱导解离。碰撞诱导解离（CIDCID）电压）电压20V(20V(氨氯地平氨氯地平) )和和40V(40V(内标物内标物) )；正离子方；正离子方式检测；扫描方式为选择反应监测（式检测；扫描方式为选择反应监测（SRMSRM），用于定量），用于定量分析的二级碎片离子分别为分析的二级碎片离子分别为m/z238(m/z238(氨氯地平氨氯地平) )和和m/z116m/z116（内标物（内标物4 4羟基普罗帕酮），扫描时间为羟基普罗帕酮），扫描时