本科生实验指导

1、实验指导实验十一外源基因在大肠杆菌中的表达实验目的 了解IPTGIPTG（异丙基-D-D-硫代吡喃半乳糖）诱导的外源基因在大肠杆菌中的表达的原理，掌握外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测技术。实验原理 将外源基因克隆在含有laclac启动子的表达载体中，让其在大肠杆菌中表达。 没有加入IPTGIPTG诱导剂的时候，laclac产生的阻遏蛋白与laclac操纵子结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，而只有表达载体随大肠杆菌的增殖和复制：当加入IPTGIPTG后，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNADNA外源基因大量转录并高效表达。表达的蛋白可以通过SDS-PAGESDS-PAGE（十二烷基硫酸钠

2、聚丙烯酰胺凝胶电泳）进行初步鉴定。 LacLac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNADNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)(LacI)、启动基因(P)(P)、操纵基因(O)(O)和编码3 3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。LacLac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMPcAMP来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZLacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操

3、纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTGIPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。 乳糖启动子实验内容材料：大肠杆菌菌株DH5和BL21以及表达载体PET-32PET-32（+ +）主要试剂： LB LB平板（含5050g/mlg/ml的卡那霉素），100mMIPTG,10mg/ml100mMIPTG,10mg/ml的溶菌酶（10mM 10mM Tris-HCl,pH8.0Tris-HCl,pH8.0配制）。 Amp Amp（氨苄青霉素）贮存液：用三蒸水配成100mg/ml,100mg/ml,用0.22m0.22m滤膜过滤除菌，分

4、装后-20-20保存。 LB LB液体培养基：10g Trptone,5g Yest Extract,10g NaCl,10g Trptone,5g Yest Extract,10g NaCl,加去离子水定容至1000ml,1000ml,高压灭菌，冷却后44保存。 LA LA液体培养基：10g Trptone,5g Yest Extract,10g NaCl,10g Trptone,5g Yest Extract,10g NaCl,加去离子水定容至1000ml,1000ml,高压灭菌，待灭菌好的培养基温的度降至6060左右时，加入AmpAmp至浓度100g/ml100g/ml，44保存。 LB

5、 LB固体培养基：在LBLB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度1.5%1.5%（w wv)v)，高压灭菌，冷却至约5050后分装如灭菌平皿中，凝固后44保存。 LA LA固体培养基：待灭菌好的LBLB固体培养基的温度降至6060左右时，加入AmpAmp至终浓度100g/ml100g/ml，摇匀后分装入灭菌平皿中，凝固后44保存。 50 50TAE:750mlTAE:750ml去离子水中加入242gTris,57.1ml 242gTris,57.1ml 乙酸，NaNa2 2EDTA 37.2g,EDTA 37.2g,用去离子水定容至1000ml1000ml。 IPTG IPTG（1mol1molL)

6、:8mlL):8ml去离子水溶解2.3831gIPTG2.3831gIPTG后定容至10ml10ml，再用0.220.22mm滤膜过滤除菌分装入1.5ml 1.5ml EppendenfEppendenf灭菌离心管中，-20-20保存。实验仪器与设备 空气摇床，生化生化陪养箱 Eppendenf 5804R Eppendenf 5804R 低温高速离心机 Eppendenf Gentrifuge 5410D Eppendenf Gentrifuge 5410D 台式高速离心机 Eppendenf BiopHotometer Eppendenf BiopHotometer METTLER TOL

7、EDO AB204-E METTLER TOLEDO AB204-E分析天平 TS-1 TS-1脱色摇床 超净工作台 水浴摇床 垂直电泳槽 凝胶成像系统 操作步骤1 1 大肠杆菌BL-21BL-21感受态细胞的制备。2 2 重组质粒pET-32pET-32（+ +）- -actRBactRB转化到大肠杆菌BL-BL-2121细胞。3 3 将含有重组表达载体pET-pET-3232（+ +）- -actRBactRB和空表达载体pET-32(+)pET-32(+)的大肠杆菌BL21BL21划线接种在LBLB平板上，3737培养过夜，直至平板上生出菌落。4 4 挑取单菌落至5mlLB5mlLB液体

8、培养基中，培养至OD600=0.6OD600=0.6左右，44放置过夜。5 5 将LB-PET-LB-PET-3232（+ +）- -actRBactRB菌液接种到3mlLA3mlLA液体培养基中，3737，200rpm200rpm振摇培养过夜。6 6 取100L100L培养过夜的菌液接种到3mlLA3mlLA液体培养液中，3737，200rpm200rpm振摇培养至OD600OD600至0.6-0.80.6-0.8时，加入1M1M的IPTG,IPTG,使IPTGIPTG终浓度分别为1mM,1mM,置3737摇床继续诱导培养6h6h，收集菌体置-20-20保存备用。7 7 另取不含目的基因片段

9、的质粒pET-32pET-32（+ +）转化BL21BL21感受态细胞做相同处理，加IPTGIPTG诱导6h6h作对照。注意事项1 1 大肠杆菌的表达水平与IPTGIPTG浓度、诱导时间、温度以及宿主菌的生长状体有关。当表达量不高时，可以调节IPTGIPTG的浓度、诱导时间和温度，甚至重新转化。2 2 菌液的ODOD值要摇到0.6-0.80.6-0.8，否则会直接影响到蛋白的表达量。思考题1 1、哪些因素会影响大肠杆菌的表达？2 2、IPTGIPTG诱导蛋白表达原理？实验十二目标蛋白的PAGE检测实验目的 了解蛋白质分离纯化及检测方法实验原理 不同的蛋白质分子具有不同的电荷和分子量。蛋白质在强

10、阴离子去污剂SDSSDS与某一还原剂（如二巯基乙醇）共同作用下并加热使蛋白质解离后，变性的蛋白质与SDSSDS结合并因此而带负电荷，不同的蛋白质结合SDSSDS的量仅与分子量成正比而与氨基酸的序列无关，在SDS-PAGESDS-PAGE电泳时，蛋白质在聚丙烯酰胺中的迁移率仅仅取决于蛋白质的分子量。 聚丙烯酰胺凝胶电泳由丙烯酰胺单体和交联体N,NN,N-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下，形成三维网状结构。凝胶电泳不仅具有分辨不同分子量蛋白质的作用，还具有浓缩作用。由于不连续缓冲系统具有把样品中的SDS-SDS-多肽复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而提高了分辨率。采用考马斯亮蓝快速染色，可以及时观

11、察电泳分离的效果。实验试剂 30%30%（w w/v/v）凝胶贮存液：丙烯酰胺29g29g，亚甲基双丙烯酰胺1g1g，加ddHddH2 2O O溶至100ml100ml，用新华3 3号滤纸过滤，棕色瓶中44保存，（丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套和口罩）。 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl、0.5mol/L pH6.8 0.5mol/L pH6.8 Tris-HClTris-HCl、10%SDS10%SDS、10%10%过硫酸铵、TEMEDTEMED。 Tris- Tris-甘氨酸电泳缓冲液，pH8.3pH8.3，可配成5 5贮

12、存液备用，临用前稀释。 工作液 5 5贮存液 Tris Tris碱 25mmol 25mmol/L Tris/L Tris碱 15.1g15.1g 甘氨酸 250 250mmolmmol/L/L（pH8.3pH8.3） 甘氨酸 94g 94g SDS 0.1% 10%SDS SDS 0.1% 10%SDS 50ml50ml 加ddHddH2 2O O定容至1000ml1000ml 样品处理液 Deionized water 3.8ml 0.5mol/L Tris-HCl pH6.8 1.0ml0.5mol/L Tris-HCl pH6.8 1.0ml Gglycerol 0.8ml Gglyc

13、erol 0.8ml 10% 10%（w w/v/v）SDS 1.6mlSDS 1.6ml 2-mercaptoethanol 0.4ml 2-mercaptoethanol 0.4ml 1% 1%（w w/v/v）bromophenol blue 0.4mlbromophenol blue 0.4ml染色液 0.4% 0.4%考马斯亮蓝-R250-R250染色液 甲醇 400ml 400ml 冰乙酸 100ml 100ml 考马斯亮蓝R250 1g R250 1g 加ddHddH2 2O O定容至1000ml1000ml脱色液 甲醇 400ml 400ml 冰乙酸 100ml 100ml d

14、dH ddH2 2O 500mlO 500mlSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液配方（1 1）30%30%凝胶贮备液：29%29%丙烯酰胺，1%1%亚甲基双丙烯酰胺，用去离子水配制后0.450.45mm的硝酸纤维素膜过滤，44避光保存。每隔几个与须重新配制。（2 2）10%SDS10%SDS：用200ml200ml水溶解25g25g电泳级SDSSDS，加热到6868并用磁力搅拌器搅拌至溶解，加入浓HClHCl调节pHpH值至7.27.2，再定容至250ml250ml，室温保存。（3 3）10%10%过硫酸铵：在5ml5ml水中溶解0.5g0.5g过硫酸铵。（APAP，新鲜配制）。（4 4）Tri

15、s-Tris-甘氨酸电泳缓冲液（5 5）：在900ml900ml去离子水中溶解15.1gTris15.1gTris碱和94g94g甘氨酸，然后加入50ml 10%50ml 10%电泳级SDSSDS贮存液，用去离子水定容至1000ml1000ml后常温保存。（5) 25) 2SDSSDS凝胶上样缓冲液：在40ml40ml去离子水中溶解1.211g Tris1.211g Tris碱、20ml20ml甘油、4gSDS4gSDS、3.1gDTT3.1gDTT与10mg10mg溴酚蓝，用1mol/L HCl1mol/L HCl调节pHpH值至6.86.8后加入去离子水定容至100ml100ml，-80-

16、80保存。（6 6）考马斯亮蓝染色液：200ml200ml甲醇，50ml50ml冰乙酸，0.5g0.5g考马斯亮蓝R250,250mlR250,250ml去离子水。用Whatman1Whatman1号滤纸过滤后室温无限保存。（7 7）脱色液:250ml:250ml甲醇，80ml80ml冰乙酸，680ml680ml去离子水。（8 8）1.5mol/L Tris-HCl1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8pH8.8）分离胶缓冲液：18.165g Tris18.165g Tris碱，溶解于40ml40ml水后用1mol/L HCl1mol/L HCl调节pHpH值至8.88.8，加水定容至

17、100ml100ml后用0.45m0.45m滤膜过滤44保存。（9 9）1mol/L Tris-HCl1mol/L Tris-HCl（pH6.8pH6.8）积层胶缓冲液：12.11g Tris12.11g Tris，溶解于40ml40ml水后用1mol/L HCl1mol/L HCl调节pHpH值至6.86.8，加水定容至100ml100ml后用0.45m0.45m滤膜过滤44保存。实验操作（1 1）样品处理 取1ml1ml菌液，10000rpm10000rpm离心1min1min，弃上清，重悬于5050LL去离子水，加入5050LL 2 2SDSSDS凝胶上样缓冲液，涡旋混匀，100100加

18、热10min10min，10000rpm10000rpm离心3min3min备用。（2 2）SDS-PAGESDS-PAGE凝胶的制备 按下列配方组成配制4ml 12%4ml 12%分离胶 12% 12%的蛋白质SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离层配方 成分 体积/mL/mL 水 1.6 1.6 30% 30%丙烯酰胺混合液 1.32 1.32 1.5mol/L Tris 1.5mol/L Tris（pH8.8pH8.8） 1 1 10%SDS 0.04 10%SDS 0.04 10% 10%过硫酸铵 0.04 0.04 TEMED 0.002 TEMED 0.002 一旦加入TEMED,TE

19、MED,混匀后立即小心将分离胶注入准备好的玻璃间隙中，注意为浓缩胶留有足够的空间（约1 1/3/3空隙体积）。轻轻在其顶层加入1ml1ml去离子水，阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用并磨平胶平面。 聚合完成之后，倒掉覆盖在凝胶上层的水，用滤纸吸干凝胶顶层的残存液体。 按下列配方组成配制1ml 5%1ml 5%浓缩胶 5% 5%的蛋白质SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓缩层配方 成分 体积/mL/mL 水 0.675 0.675 30% 30%丙烯酰胺混合液 0.1675 0.1675 1.0mol/L Tris 1.0mol/L Tris（pH6.8pH6.8） 0.125 0.125 10%

20、SDS 0.01 10%SDS 0.01 10% 10%过硫酸铵 0.01 0.01 TEMED 0.001 TEMED 0.001 将浓缩胶灌入分离胶上面，插入梳子，垂直放置于室温下 浓缩胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳子。将凝胶放入电泳槽上，加入电泳缓冲液，小心拔出梳子。（3 3）电泳 安装好电泳槽，把电泳槽置于冰盒内，将电极插头与适当的电极相连。 开始时电压为60V60V，染料进入分离胶后，将电压增加到90V90V，继续电泳直到染料到达分离胶底部，断开电源。 取下凝胶，将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中放摇床上缓慢旋转3-4h3-4h或过夜。 换掉并回收染色液。用脱色液浸泡凝胶，缓慢摇动4-8h

21、4-8h，其间换液3-43-4次。继续脱色，直到满意为止。 用凝胶成像系统对凝胶进行照相和分析。注意问题（1）胶脱色不能脱的太久，虽然越脱越清楚，但脱的太久了，弱带就看不见了，胶也会变的失真，这样的胶照出的照片是很难被接受的。如果样品条带或点不是很浓，就不可以脱太久。但如果要拍照，最起码要保证底色脱完全，要不然照片效果也不会好的。（2）如果需要长时间脱色，注意要换脱色液,且量要足够,否则甲醇挥发很快,胶容易干卷.把本底脱干净后可以把胶放水中保存.半个月应该没问题；分子克隆：长期保存可以在水中加20%的甘油。也有站友经验：考染不能长时间保存，尤其是在水里，3天颜色就会溶到水里。具体情况要自己摸索

22、了。胶一般应放20%的甘油中长久保存（见“分子克隆”） 影响蛋白质电泳分离效果的因素1 1、蛋白质样品中的盐浓度 影响蛋白条带的迁移率和带型，因此为消除盐浓度的影响，溶解蛋白质时最好用去离子水，再加等量 2 2SDS-PAGESDS-PAGE样品缓冲液，必要时经过透析或进行Sephader G25Sephader G25过柱。2 2、SDSSDS质量 由于变性蛋白质是与SDSSDS结合而带负电荷，蛋白质结合SDSSDS的量与蛋白质的分子量成正比，因此质量不同的SDSSDS，相同的蛋白质样品，将可能出现不同的迁移率的电泳图谱。3 3、上样孔是否平齐 若上样孔不平齐，也影响蛋白质电泳的迁移率4 4

23、、为防止相邻永道样品的扩散，而导致电泳条带的不整齐，如有空置的加样孔，须加等体积的空白1 1SDSSDS样品缓冲液。注意事项1 1、PAGEPAGE胶作用过程中注意积层胶和浓缩胶的比列，否则会影响电泳效果。2 2、制胶过程中注意各种成分加入的先后顺序，保证制胶质量。3 3、上样时注意每孔的上样量防止样品间相互污染。思考题1 1、在PAGEPAGE电泳过程中浓缩胶和积层胶的作用分别是什么？2 2、样品为何用SDSSDS处理，且要煮沸？THE END 实验十一外源基因在大肠杆菌中的表达实验目的 了解蛋白质分离纯化及检测方法（5) 25) 2SDSSDS凝胶上样缓冲液：在40ml40ml去离子水中溶解1.211g Tris1.211g Tris碱、20ml20ml甘油、4gSDS4gSDS、3.1gDTT3.1gDTT与10mg10mg溴酚蓝，用1mol/L HCl1mol/L HCl调节pHpH值至6.86.8后加入去离子水定容至100ml100ml，-80