AIDS实验室检测-0807

1、1HIV/AIDS 实验室检测实验室检测首都医科大学附属北京地坛医院首都医科大学附属北京地坛医院首都医科大学传染病研究所首都医科大学传染病研究所魏红山魏红山要点概述要点概述p HIV实验室检测的基本目的p HIV感染过程中的病原学及免疫学标志物p 实验室检测的基本方法p AIDS初筛实验室的管理及质量控制 HIV实验室检测的病原学基础 HIV感染后病毒学参数变化特征 HIV感染后的免疫学参数 筛查实验的基本方法和原理 确认试验原理及结果判定 病情监控及预后判定检测 近期HIV感染患者的识别:STARSH分析 HIV耐药检测：基本原理及方法 HIV测试实验室质量控制的必要性 HIV检测实验室的生

2、物安全管理2HIV实验室检测的基本目的实验室检测的基本目的1.为HIV感染提供确认，病程监控，以及预后判定提供依据2.为输血提供安全保障，用于献血员筛查3.服务于自愿咨询人员，提供自愿健康体检筛查4.服务于特殊的医疗过程，如器官移植，手术，输血前后的筛查5.治疗方案的规划与调整，如耐药检测，分型检测3HIV感染过程中的病原学及免疫学标志物感染过程中的病原学及免疫学标志物HIV实验室检测的病原学基础实验室检测的病原学基础年代年代HIVHIV研究关键事件HIV突破种属屏障，开始感染人类Gottlieb, Friedman-Kien 最初病例报告 (Kaposis 肉瘤, 卡氏肺囊虫肺炎), AID

3、S 被首次作为一种新的临床疾病认识美国CDC 首次明确AIDS的定义Montagnier 和 Gallo 鉴定AIDS致病病原体 - HIV (既往称之为 HTLV III/LAV)首个抗逆转录病毒药物 - zidovudine (ZDV, 正式名称 AZT)Montagnier等发现HIV-2首个蛋白酶抑制剂被批准使用，用于和核苷类似物类药物联合使用AIDS发病率在美国开始下降4法 国 巴 斯 德 研 究 所Montagnier和美国人类病毒学研究所Gallo分离并鉴定 ， 因 该 项 成 就Montagnier等人获2008年度诺贝尔奖。5 病毒颗粒基本结构病毒颗粒基本结构qCore核心核

4、心: Viral nucleic acid (DNA or RNA)qCapsid衣壳衣壳: Protein shell Core + Capsid = nucleocapsid (核壳体）核壳体）qEnvelope包膜：包膜：qSpike刺突刺突 RNaked virus：裸露病毒：裸露病毒: Nucleocapsid = virion. REnveloped virus：包膜病毒：包膜病毒:Nucleocapsid + Envelope = virion Special structure：特殊结构：特殊结构: e.g. 逆转录酶RBC直径约为10000 nmHIV 基因组结构及编码蛋白特

5、征gagpolenvvpr revnefviftat vpuLTRLTR启动转录核心蛋白（核壳膜）编码代谢酶编码受体结合蛋白9200 bp结构基因env基因：gp120，gp41gag基因：p17，p24功能基因：pol基因：逆转录酶，蛋白酶，整合酶功能辅助基因：调节结构基因、功能基因转录与表达 Vif，Tat，Vpu，Vpr，Rev，NefHIV基因组7u Env刺突由3个gp120亚单位非共价连接，与3个gp41亚单位形成的异源性三聚体蛋白位于病毒颗粒的外侧。u Gp120与CD4结合后，暴露辅受体结合位点，gp120与辅受体CCR5和CXCR4结合u Gp41介导病毒颗粒与细胞膜的融合，

6、将核壳体释放到靶细胞内。u 病毒逆转录酶 介导RNA逆转录成cDNA，通过核孔转移至细胞核，形成整合前复合体。u 病毒整合酶 催化HIV基因组整合到人体染色体上。转录形成病毒mRNA。病毒mRNA转移出细胞核，翻译成病毒蛋白。u Gag蛋白，病毒基因组RNA，env糖蛋白复合体，以及GagPol前体蛋白组装病毒颗粒发生于浆膜侧。Gag蛋白上的顶端正电碱性片层，引导Gag定位与浆膜上的磷脂酰肌醇结合区。u 病毒蛋白与病毒基因组mRNA组装成新病毒颗粒。伴随新病毒颗粒的释放，病毒蛋白酶 清除Gag和GagPol多聚蛋白前体，导致病毒颗粒成熟和释放。HIV env基因编码包膜糖蛋白的基本结构9图1.

7、 env蛋白的三聚体结构及其光谱中和表位的分布.M.J. van Gils, et al. Virology 2013;435: 4656 新生三聚体新生三聚体与与CD4结合结合与辅助受体结合与辅助受体结合融合融合HIV入侵细胞基本机制入侵细胞基本机制Klasse PJ. Cellular Microbiology 2012;14:11831192.HIV包膜蛋白细胞内穿行与病毒颗粒的组装J Mol Biol 2011;410:582-608HIV组装基 本 机制J Bio Chem 2012;287:40867-40874Nature 2011;469:424-427HIV感染过程中的病原学

8、及免疫学标志物感染过程中的病原学及免疫学标志物HIV感染后病毒学参数变化特征感染后病毒学参数变化特征HIV感染后感染后，血液中最早可以检测的标志物是HIV RNA和p24抗原。其中病毒RNA最早可以在感染后2周内检出。随后滴度逐渐增加，在感染后的2个月可以高达200万拷贝/毫升血浆。同时出现体液和细胞免疫反应。这些免疫反应可以控制HIV复制，并可以大幅度降低RNA水平，使RNA水平达到一个恒定的水平，即所谓的调定点。根据这个调定点的水平可以预测随后感染的病程特征：调定点水平越高，疾病进展就越迅速，就会越快进展到AIDS。相反，调定点水平越低，疾病的进展就越缓慢。在感染的后期阶段，RNA水平再次

9、逐渐增加，并在AIDS相关症状出现时再次达到一个很高的水平14某公司试剂检测HIV/AIDS，相应标志物的变化特征AIDS实验室检测基本方法实验室检测基本方法诊断性检测诊断性检测初筛实验：IFA、ELISA:1985第一代试剂开始使用确认实验：Western blot，线性印迹预后判定性检测预后判定性检测T细胞亚群检测：流式细胞仪技术HIV RNA检测：几种核酸技术HIV耐药检测耐药检测表型耐药：细胞培养技术基因型耐药：序列测定，杂交技术16初筛实验：双抗体夹心ELISA的基本原理HIV ELISA诊断试剂的历史沿革诊断试剂的历史沿革代次代次年份年份方法方法抗原来源抗原来源特点特点窗口期窗口期

10、第一代1985间接法纯化的HIV病毒裂解抗原对细胞培养蛋白成份发生交叉反应，假阳性较多，血清要高度稀释，敏感性低，仅含HIV-1约1-3个月（6-8周可检出）第二代1990间接法基因重组抗原合成肽抗原无细胞培养蛋白导致的假阳性，敏感性特异性均较第一代有所提高。只能测IgG。1992年批准HIV1/2比第一代平均缩短20.3天（4-5周可检出）第三代1992双抗原夹心法基因重组抗原合成肽抗原可检测HIV不同的抗体亚类（IgG、IgM、IgA等）敏感性、特异性均较高。1996年出现HIV/1/2/O试剂比第二代平均缩短4-9天（14-25天可检出）第四代1998双抗原夹心法抗体捕获重组、合成肽，P

11、24抗原的单克隆抗体检测HIV1/2/O抗体和P24抗原，称HIV抗原/抗体试剂，可进一步降低输血的残余危险度三代平均缩短4-7天（10-18天可检出）1819HIV/AIDS快检试剂快检试剂原理：乳胶凝集、免疫斑点和免疫层析，金标法最多，原理：乳胶凝集、免疫斑点和免疫层析，金标法最多，可进行全血、血清、以及尿液检测可进行全血、血清、以及尿液检测特点：费时短、不要求特殊设备、适用于应急和基层特点：费时短、不要求特殊设备、适用于应急和基层使用，最大缺点是价格高，敏感度和特异度低于使用，最大缺点是价格高，敏感度和特异度低于EIA，不适于城市内的血液筛查。不适于城市内的血液筛查。20确认实验：Wes

12、tern blot基本流程u 美国CDC：2条带应该分别是gag和env基因产物u WHO：可以是env基因产物两条带u 美国红十字会：应该至少gag, env, pol基因各显示1条带确认实验结果判定22p一旦确诊感染一旦确诊感染HIV，重要的是对病情进行监控，并给予重要的是对病情进行监控，并给予合理抗病毒治疗，以延缓病情的进展。合理抗病毒治疗，以延缓病情的进展。p病毒抗原检测最早用于预后判断，但目前已经病毒抗原检测最早用于预后判断，但目前已经基本被基本被CD4检测缩替代，观察检测缩替代，观察P24抗原应该考虑到晚期抗原应该考虑到晚期表达水平下降的问题。表达水平下降的问题。p病毒载量检测病毒

13、载量检测 直接评估直接评估 HIV-RNA 常用的方法包括常用的方法包括 RT-PCR, NASBA, 以及以及 bDNA. 是目前常用的技术。是目前常用的技术。pT细胞亚群检测是目前判定患者预后及决定治疗方案的细胞亚群检测是目前判定患者预后及决定治疗方案的重要方法。重要方法。预后判定检测预后判定检测23T细胞亚群检测的病理依据及意义数量下降：细胞毒素和自然杀伤细胞引起。外周细胞凋亡, 未分化细胞死亡。淋巴腺空泡和特殊的凋亡。 功能丧失： 分布外周血中的在幼稚和记忆和其它未知功能细胞变化导致免疫反应削弱。 评价免疫功能减退的程度和评价免疫功能减退的程度和AIDS进程进程 指导治疗策略的制订指导

14、治疗策略的制订 确定预防机会感染的最佳时机确定预防机会感染的最佳时机 监控监控抗逆转录病毒抗逆转录病毒（ARV）治疗、细治疗、细胞因子治疗和保护治疗性疫苗的疗效胞因子治疗和保护治疗性疫苗的疗效 2425液流系統液流系統 利用鞘液（FACSFlow Sheath Fluid）將細胞依序送至測量區受檢光學系統光學系統 利用雷射光源、透鏡、光柵、濾片與反射鏡等激發並收集細胞產生之螢光與散射光，並導至各探測器內電子系統電子系統 1.將探測器測到的光學訊號轉換為電子訊號2.分析所輸出的電流訊號，以脈衝高度(H)、寬度(W)、積分面積(A)顯示3.量化並放大訊號傳至電腦流式細胞儀的基本組成26BD FAC

15、SCaliburTM 多色分析仪多色分析仪Dichroic MirrorsBandpass FiltersDetector#1Detector#2CD3CD19CD45CD14CD14CD14CD16/CD5631Suppressor T cellR1T cell / B cellHelper T cell 细胞亚群的细胞获取数 Beads 总量 细胞亚群的 X = Beads获取数 样本量 (l) 绝对数（细胞数/ l）CD45 PerCPSSC流式细胞仪流式细胞仪T细胞亚群绝对计数原理细胞亚群绝对计数原理MMWR, 2003: 52(RR02);1-1332RT-PCRbDNANASBAL

16、Cx HIV RNA检测的方法检测的方法RT-PCR、NASBA检测属于PCR方法，其中包括抽提RNA的步骤，所以较容易受污染，而使RNA降解bDNA与RT-PCR、NASBA相比较有较好的稳定性、线性和可重复性 1.特殊人群：怀疑急性期感染者，母婴传播，核酸检测能够提供早于免疫学指标的诊断，已经被认为是18个月以下婴幼儿诊断的金标准。2.除早期诊断外，HIV RNA测定能够监测HIV慢性感染者病情的发展。3.以及作为评价HAART治疗效果的评价指标。4.应用核酸杂交法或应用PCR法检测HIV的前病毒DNA可确定细胞中HIV潜伏感染情况。5.由于其固有的高敏感性，某些国家已经采用这种技术用于献

17、血员的筛查，被认为与经典免疫学筛查方法相比，可以降低输血传播约50%。33NASBA 技术pNASBA (Nucleic acid sequence-based amplification) 早期产品为NASBA HIV-1 RNA QT定量RNA测定方法，现已被最新版本的方法NucliSens HIV-RNA QT assay取代。pNASBA技术是一种等温扩增系统，其扩增基础在于系统内的混合酶系统，此系统内含有逆转录酶AMV-RT和T7-DNA多聚酶，以在体外模拟逆转录病毒体内复制过程。 Triton X-100裂解病毒提取核酸 加入铷标记的内标 电化学发光检测 根据内标计算野生株拷贝数3

18、4RT-PCR 技术基本原理是通过逆转录酶的作用将样品中RNA逆转录合成DNA后进行聚合酶链式反应（RT-PCR），方法较为简单异硫氰胍裂解液裂解病毒，释放出核酸成分。加入一个已知拷贝数量的合成RNA分子作为定量标准（QS），然后进行RNA提取。使用引物在逆转录酶的作用下逆转录产生142碱基的gag基因片段（DNA），通过PCR方法对此基因片段进行扩增。清洗掉未杂交的反应产物后再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素，亲和素与扩增产物上的生物素结合HRP的底物进行显色反应，测定OD值。35bDNA 技术bDNA测定技术基于其独特的信号放大系统，即bDNA信号放大系统，这是一个人工合成的bDN

19、A，bDNA的分枝可结合多个酶标记物，从而将病毒的信号放大，以便进行检测。此检测系统不涉及核酸扩增反应首先将血浆样品离心，浓缩其中的病毒颗粒，HIV RNA释放后加入微孔板中板孔中包被有可与病毒特异结合的一系列靶探针，靶探针的一端可标记在游离的病毒核酸链上，另一端可与bDNA结合，加入酶标记物对结合的bDNA进行标记经过清洗后加入底物进行反应，测定反应强度本方法定量系统中没有内标记物，每次实验设置一系列外部标记，通过实验样品反应强度与外部标记样品强度的比较确定实验样品的病毒拷贝数。36pHIV RNA 应该在感染后从血清转换至AIDS 全程可以检测地到。但实际感染者中许多血清HIV RNA 水

20、平并不高，有些患者在无症状阶段甚至低于400 拷贝/毫升。p对于一些敏感性不高的试剂盒，该阶段可能会出现HIV RNA 检测阴性的结果。p其它一些因素也会影响检验结果的准确性 地理因素感染亚型和循环中病毒重组的影响 病毒变异导致扩增引物特异性变化 病毒准种复杂性HIV RNA检测结果解读注意事项37近期近期HIV感染患者的识别感染患者的识别:STARSH分析分析新近感染的识别有助于HIV传播模式的评价新近HIV血清学转换测试算法（STARSH）是一系列分析方法这些分析方法主要是基于HIV感染后一系列典型的免疫学事件这些分析方法一旦在HIV特异性抗体生成，并不能鉴别哪些患者是慢性感染者，哪些是新

21、近感染者总体评价38近期近期HIV感染患者的识别感染患者的识别:STARSH分析分析常用方法“失调”分析（detuned assay）该技术基于HIV感染早期阶段诱导机体所产生的抗体亲和力和滴度都比较低，而随着疾病的进展，HIV特异性抗体的亲和力和滴度都逐渐升高。因此，联合一种高敏感试剂盒和相对低敏感试剂盒对标本进行分析即可达此目的。BED-捕获酶免分析（CEIA）BED-捕获酶免分析是一种商用产品，其原理是基于HIV-特异性IgG抗体占血清总IgG抗体比例，藉此推断感染大致时间。早期感染，HIV特异性IgG占总IgG比例较慢性感染低，并随着感染时间延长而逐渐增加。39近期近期HIV感染患者的

22、识别感染患者的识别:STARSH分析分析常用方法亲和指数分析亲和指数分析这种方法是基于HIV感染越早，HIV抗原与诱导产生的抗体亲和力越低的事实。基于抗原-抗体的亲和力指数对感染时间进行判定。具体来说，将患者的血清标本首先采用离液剂，诸如盐酸胍，断开维持抗体二级结构及与抗原相互作用的氢键。然后重新对抗体亲和性进行分析。IDE-V3免疫分析免疫分析IDE-V3免疫分析是一种基于env编码糖蛋白上的两个保守的免疫表位：一个表位在gp41上，另一个表位在gp120上的V3区。根据不同寡肽的抗体亲和模式，可以将感染分为180内的感染和180天后的感染40STARSH分析受很多因素的影响：主要有以下几点

23、：近期近期HIV感染患者的识别感染患者的识别:STARSH分析分析影响因素1. HIV的高度变异性仍然是主要因素，不同分离株之间免疫优势表位的差异，必然影响抗体的差异2. 病程的限制，诸如AIDS阶段患者抗体的浓度低下3. HAART治疗的影响，药物治疗可以显著影响体内病毒株的准种进化，因而对检验结果也有相应的影响41n不同亚型之间gp120的差异高达35%. n有效诱导广谱中和抗体的表位，深埋于蛋白结构内部。n尚不清楚控制HIV-1复制免疫反应的实质，诸如免疫反应的控制，血清阴性患者的高危因素Taylor, B.S., et al. N. Engl. J. Med. 2008;358:159

24、01602. Barouch, D.H., 2008. Nature 455, 613619. Lederman, et al., J. Infect. Dis.2010;202:S333S338. HIV抗病毒治疗的目的抗病毒治疗的目的u延缓病情进展u恢复免疫系统的功能u改善患者的生存质量HIV抗病毒药物的分类及方案抗病毒药物的分类及方案u核苷类逆转录酶抑制剂：竞争逆转录酶的底物u非核苷类逆转录酶抑制剂：与逆转录酶的转录活性位点p66疏水口袋结合，阻断逆转录酶异位，位点专一高效u蛋白酶抑制剂u侵入抑制剂和融合抑制剂u整合酶抑制剂高效的抗病毒治疗方案需要3种或3种以上药物联合使用。截止2008

25、年3月，FDA批准了1种进入抑制剂，1种融合抑制剂，1种整合酶抑制剂，17种逆转录酶抑制剂，11种蛋白酶抑制剂。HIV耐药产生的原因：耐药产生的原因：u 自发突变-原发性耐药u 药物压力选择-继发性耐药每天体内大约产生1010个病毒颗粒，每个核苷酸位点每次复制变异频率为310-2，多位点变异导致逆转录酶和蛋白酶空间结构变化，使HIV对药物不再敏感。不规范的治疗、不合时机的给药都会导致耐药的产生。HIV耐药的基本认识耐药的基本认识44u当1种或1类抗HIV药物不再有效，则被认为HIV耐药。uHIV-1耐药意味着病毒可以在药物环境中适应，生长，以及复制。uHIV感染者3/4的患者治疗失败与耐药有关

26、u约1/4的新感染患者已经对至少1类抗HIV药物耐药（原发耐药）耐药产生的分子机制耐药产生的分子机制u蛋白酶抑制剂：1）结合位点变异导致酶与竞争底物（药物）结合力降低；2）催化部位变异导致代偿性催化活性增强u核苷类似物类逆转录酶抑制剂导致的突变多发生于5-端编码区u非核苷类似物：1）逆转录酶空间构象改变；2）增强焦磷酸水解，使DNA合成加速HIV耐药检测的意义耐药检测的意义u 为临床提供患者治疗方案抉择的整体信息：病史，病毒载量，以及CD4+T计数u 避免使用已经耐药的药物，降低患者的副作用及治疗费用u 有效治疗方案，药物筛选的依据何时进行何时进行HIV耐药检测？耐药检测？u 抗病毒治疗前：1

27、）明确原发性耐药；2）动态监测耐药进展特征u 治疗失败后：明确何种药物，或何种方案不再有效u 全程监控：明确耐药位点动态变化与耐药表型之间的关系那些药物耐药？那些药物耐药？u 美国的部分资料显示76%的病毒株至少对一种核苷类似物药物耐药对蛋白酶抑制剂耐药率40.5%对非核苷类逆转录酶抑制剂耐药率25.2%对2种或3种治疗药物同时耐药率分别为47.1%和13.1%Richman DD, et al. AIDS 2004;18:1393-1401u 我国的部分资料显示初治6个月，耐药发生率62.7%新发患者15%的患者携带耐药株Zhang X, et al. AIDS 2007;21Suppl8:

28、S53-S57基因型耐药检测基因型耐药检测n原理：RT-PCR获取RT、PR基因，然后进行分子杂交或核酸测序。n方法：w特异性引物扩增w差异杂交分析w线性探针分析w基因芯片分析48能够提供治疗方案中每种药物的耐药情况，是对耐药的直接测量结果容易理解对病史，治疗方案复杂的患者，结果容易理解便于新药耐药分析便于新突变位点的识别仅能对优势耐药株的耐药情况进行分析， 1000 copies/ml费用较高检测周期较长：34 周能直接测出HIV-1对药物的敏感度，并能揭示事先存在或交叉的耐药情况，有利于指导HIV-1感染者有效地用药。目前市面上供应试剂盒已有2种，即AV（Vicro Antivirogra

29、m）和PS（Virologic PhenoSense），两者方法均应用从生长于载体中的HIV-1而获得的重组病毒和病人标本中蛋白酶与逆转录酶序列，分析与野病毒之间IC50值相差倍数，一般达510倍以上为阳性。各种药物引起HIV变异其位点不一样，这种方法的最大优点是可以获得各种药物耐药量度数据，但不足的是试验慢又昂贵，技术要求高。HIV表型耐药性测试方法52鉴别混合病毒株中，突变的水平在10%-50%结果由一定的“预测”性，可能在实际耐药前检出实验周期短：5001000 copies/ml难以明确次要病毒株的变异对结果的理解需要一定的基础知识背景，关联性分析等不同实验室之间分析方法，对结果的理解

30、有差异虚拟表型分析法虚拟表型分析法p原理：用基因型结果解释表型类型。p特点：需要建立基因型相关表型数据库。 能够把复杂的基因型资料转化为简单的表型资料，便于临床医生理解、决策。 对NNRTIs和PI类药物预测较好；对NRTIs预测较差。 需要建立经验性数据库。56Stanford University HIV Resistance Database: / UCSF Database of Antiretroviral Drug Interactions: /insite?page=ar-00-02 HIV Drug Interactions: / HIV耐药的预防耐药的预防u治疗方案的依从性是预防耐药的关键环节：每剂，每次，每天的依从性u避免HIV-1感染的传播，是原发耐药株的传播核心阻断环节AIDS初筛实验室的管理及质量控制初筛实验室的管理及质量控制必要性必要性：HIV检测实验室的室内质量控制与室间结果比较对HIV检测结果的持续改进非常重要。这是因为：p许多测试方法可以用于HIV感染或A