DNA损伤修复与抗肿瘤药物研究

1、冯冰虹教授 DNA损伤修复与抗肿瘤药物研究2基因突变（gene mutation）: 在生物进化过程中，由于生物体内外环境多种因素的影响，使遗传物质的结构改变而引起遗传信息的改变，均可称为突变。 从分子水平来看，突变主要表现为DNA分子上碱基的改变。 在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤（DNA damage）。突变的意义3（一）突变是进化、分化的分子基础。（二）只有基因型改变，而无可察觉表型改变的 突变（基因多态性：用于描述个体之间的 基因型差别现象）。（三）致死性的突变（利用此特性消灭有害病原 体）。（四）突变是某些疾病的发病基础。4第一节第一节 DNA损伤的因素和类型损伤的因素和类

2、型一、引起DNA 损伤的因素5*紫外线照射紫外线照射*电离辐射电离辐射自发突变：自发突变： 频率：频率：10-9*5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶(5-BU)*羟胺羟胺*亚硝酸盐亚硝酸盐*氮芥类氮芥类物理物理生物生物化学化学诱变因素诱变因素病毒等病毒等DNA损伤的后果信号传导异常老化肿瘤疾病异常增生和代谢生理功能紊乱细胞死亡细胞增殖减少基因表达异常基因组不稳定6（一）DNA 的自发性损伤71、DNA的复制错误的复制错误2、DNA的修复合成的修复合成 修复系统将修复系统将DNA损伤部位损伤部位的一段的一段DNA切除，再以互补链切除，再以互补链为模板重新合成为模板重新合成DNA，又称，又称DNA非程序合成非程

3、序合成。3、碱基的自发突变、碱基的自发突变脱氨基脱氨基:A、G、C环外氨基丢失环外氨基丢失碱基丢失碱基丢失:无碱基位点无碱基位点(AP部位部位)4、正常代谢产物对、正常代谢产物对DNA的损伤的损伤氧自由基氧自由基造成造成DNA链断裂链断裂（二）环境造成的DNA 损伤81、紫外线引起的、紫外线引起的DNA损伤损伤 UVT G A A C CA C T T G G胸腺嘧啶二聚体胸腺嘧啶二聚体DNA之间交联之间交联DNA与蛋白质交联与蛋白质交联DNA链断裂链断裂92、电离辐射引起、电离辐射引起DNA损伤损伤（1）导致碱基变化）导致碱基变化 主要由主要由OH自由基引起，包括自由基引起，包括DNA链上碱

4、基氧化修饰、过氧化物形成、链上碱基氧化修饰、过氧化物形成、碱基环的破坏和脱落等。碱基环的破坏和脱落等。（2）导致脱氧核糖变化）导致脱氧核糖变化 脱氧核糖上每个碳原子和羟脱氧核糖上每个碳原子和羟基上氢都能与基上氢都能与OH反应反应,导致脱氧导致脱氧核糖分解，最终引起核糖分解，最终引起DNA链断裂链断裂（3）导致）导致DNA链断裂链断裂 可使脱氧核糖破坏或磷酸二酯可使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而导致键断开而导致DNA链断裂。有单链链断裂。有单链断裂、双链断裂等不同形式。断裂、双链断裂等不同形式。（4）引起）引起DNA链交联链交联 DNA-DNA交联、交联、DNA-蛋白质蛋白质交联。是细胞受电离辐

5、射后在显微交联。是细胞受电离辐射后在显微镜下看到的染色体畸变的分子基础镜下看到的染色体畸变的分子基础103、烷化剂引起、烷化剂引起DNA损伤损伤（1）导致碱基烷基化）导致碱基烷基化 G的的N7和和A的的N3最容易烷基化，最容易烷基化，G的的N7被烷基化后改与被烷基化后改与T配对，配对， G-CA-T （2）导致碱基脱落）导致碱基脱落 G烷基化后的糖苷键不稳定，易烷基化后的糖苷键不稳定，易脱落形成脱落形成DNA上无碱基位点，复制时上无碱基位点，复制时可插入任何核苷酸，使序列改变。可插入任何核苷酸，使序列改变。（3）导致）导致DNA链断裂链断裂 磷酸二酯键上的磷酸二酯键上的O易烷基化，形易烷基化，

6、形成不稳定的磷酸三酯键，糖与磷酸间成不稳定的磷酸三酯键，糖与磷酸间发生水解，发生水解，DNA链断裂。链断裂。（4）引起）引起DNA链交联链交联单功能基烷化剂：甲基甲烷碘酸单功能基烷化剂：甲基甲烷碘酸双功能基烷化剂：双功能基烷化剂：DNA链内、链间、链内、链间、 以及与蛋白质的交联以及与蛋白质的交联 氮芥、硫芥；环磷酰胺；二乙基氮芥、硫芥；环磷酰胺；二乙基亚硝酸亚硝酸114、碱基类似物、修饰剂引起碱基对的改变、碱基类似物、修饰剂引起碱基对的改变（1）碱基类似物用作促突变剂或抗癌药物）碱基类似物用作促突变剂或抗癌药物 5-氟尿嘧啶（氟尿嘧啶（5-FU）、）、5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-BU）、）、

7、2-氨基腺嘌呤（氨基腺嘌呤（2-AP）。）。（2）某些化学物质能专一修饰）某些化学物质能专一修饰DNA链上碱基链上碱基亚硝酸盐：使亚硝酸盐：使C脱氨变成脱氨变成U，经复制使，经复制使G-CA-T羟胺：使羟胺：使T脱甲基变成脱甲基变成C，结果，结果A-T G-C黄曲霉素黄曲霉素B：专一攻击：专一攻击DNA上碱基，导致序列变化上碱基，导致序列变化这些均为诱发突变的化学诱变剂或致癌剂这些均为诱发突变的化学诱变剂或致癌剂二、DNA 损伤的类型12单点突变、多点突变单点突变、多点突变转换、颠换转换、颠换链内共价交联链内共价交联链间共价交联链间共价交联电离辐射、某些化学试剂电离辐射、某些化学试剂使链内磷酸

8、二酯键断裂使链内磷酸二酯键断裂DNA重组重组DNA损伤损伤碱基突变碱基突变DNA链断裂链断裂DNA链交联链交联插入或缺失插入或缺失单个碱基、多个碱基、单个碱基、多个碱基、一段序列的插入或缺失一段序列的插入或缺失DNA分子内发生较大片分子内发生较大片段的交换。段的交换。1. 1. 碱基和糖基破坏碱基和糖基破坏 损伤因素损伤因素酸、热去嘌呤作用、碱基修饰剂、自由基、酸、热去嘌呤作用、碱基修饰剂、自由基、活性氧、紫外线活性氧、紫外线损伤类型损伤类型碱基丢失碱基丢失/ /插入、碱基置换、插入、碱基置换、DNADNA片段缺失片段缺失/ /插入插入132. 2. 错配错配损伤因素损伤因素 碱基类似物、碱基

9、修饰剂、自发脱氨基碱基类似物、碱基修饰剂、自发脱氨基常见错配类型常见错配类型UTUT143. DNA3. DNA链断裂链断裂 损伤因素损伤因素 电离辐射、化学物质诱导电离辐射、化学物质诱导 损伤类型损伤类型单链断裂、双链断裂（最严重损伤，不能单链断裂、双链断裂（最严重损伤，不能原位修复，易致畸原位修复，易致畸) )154. DNA4. DNA交联交联 损伤因素损伤因素损伤类型损伤类型 链内交联链内交联 同一同一DNADNA链上碱基共价结合链上碱基共价结合 嘧啶二聚体嘧啶二聚体DNADNA链上相邻的两个嘧啶碱链上相邻的两个嘧啶碱 基之间共价结合，形式有基之间共价结合，形式有TTTT、CTCT、C

10、CCC链间交联链间交联 DNA-DNA-蛋白质交联蛋白质交联16DNA交联示意图17第二节第二节 DNADNA损伤的修复的机制损伤的修复的机制18常见的DNA损伤及其修复机制 DNADNA损伤因素损伤因素 DNADNA损伤类型损伤类型修复机制修复机制X射线、氧自由基、烷化剂 自发脱碱基单链断裂、无碱基位点、氧化性碱基（如8-氧鸟嘌呤）脲嘧啶碱基切除修复紫外线和多环芳烃环丁烷嘧啶二聚体等大的紫外线光产物和稳定的多环芳烃化合物等大分子DNA加合物核苷酸切除修复抗癌药（如顺铂和丝裂霉素）双链断裂和链间交联双链断裂修复（同源重组修复和末端连接）复制错误和烷化剂碱基错配和缺失（插入）错配修复19修复修复

11、(repairing(repairing) ) 是对已发生分子改变的补偿措施，使其是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。回复为原有的天然状态。光修复光修复(light repairing)(light repairing)切除修复切除修复(excision repairing)(excision repairing)重组修复重组修复(recombination repairing)(recombination repairing)SOSSOS修复修复 错配修复错配修复修复的主要类型修复的主要类型20二、二、DNADNA损伤的修复的机制损伤的修复的机制光复活酶与光复活酶与DNA

12、DNA链上嘧啶二聚体部位结合链上嘧啶二聚体部位结合 受波长为受波长为260-380 nm260-380 nm的近紫外线的近紫外线作用激活使二聚体解聚作用激活使二聚体解聚 酶从酶从DNADNA链上解离，链上解离，DNADNA恢复正常结构恢复正常结构 （一）回复修复（一）回复修复 酶学光复活酶学光复活21光修复酶光修复酶(photolyase) UV2223 嘌呤直接插入嘌呤直接插入 O O6 6- -甲基鸟嘌呤甲基鸟嘌呤-DNA-DNA的甲基转移的甲基转移 单链重接（单链断裂修复）单链重接（单链断裂修复）242022-5-232525（二）（二） 切除修复切除修复 定义定义 在多种酶的作用下，先

13、将损伤区域切除，在多种酶的作用下，先将损伤区域切除，然后利用互补链为模板，合成一段正确配对的然后利用互补链为模板，合成一段正确配对的碱基顺序来修补碱基顺序来修补切除过程切除过程切除方式切除方式识别并切除识别并切除修复合成并连接修复合成并连接2627vDNADNA分子中一旦产生了分子中一旦产生了APAP位点，位点，APAP核酸内切核酸内切酶就会把受损核苷酸的糖苷酶就会把受损核苷酸的糖苷- -磷酸键切开，并磷酸键切开，并移去包括移去包括APAP位点核苷酸在内的小片段位点核苷酸在内的小片段DNADNA，由，由DNADNA聚合酶聚合酶I I合成新的片段，最终由合成新的片段，最终由DNADNA连接酶连接

14、酶把两者连成新的被修复的把两者连成新的被修复的DNADNA链链碱基切除修碱基切除修复复(base-excision repair)(base-excision repair)。28. .糖甘水解酶识别改变了的碱基，把碱基从糖甘水解酶识别改变了的碱基，把碱基从N-N- -糖苷键处切下来，在糖苷键处切下来，在DNADNA链上形成去嘌呤或去链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为嘧啶位点，统称为APAP位点。位点。29由由APAP磷酸内切酶将受损核磷酸内切酶将受损核甘酸的糖苷甘酸的糖苷- -磷酸键切开磷酸键切开5330DNADNA连接酶连接连接酶连接利用利用DNADNA聚聚合酶合酶I I在切在切除损伤部除

15、损伤部位，补上位，补上核苷酸核苷酸312022-5-233232 核苷酸切除核苷酸切除被切除的不是单个碱基，而是一段寡核苷酸。被切除的不是单个碱基，而是一段寡核苷酸。是细胞内更为重要的一种修复方式是细胞内更为重要的一种修复方式 是是DNADNA修复的一种普遍形式修复的一种普遍形式333435识别损伤部位识别损伤部位损伤的两边切除几个核苷酸损伤的两边切除几个核苷酸DNA DNA 聚合酶以母链为聚合酶以母链为模板复制合成新子链模板复制合成新子链DNADNA连接酶将切口补平连接酶将切口补平36（三）（三） 重组修复重组修复 定义定义重组酶系将未受损伤的重组酶系将未受损伤的DNADNA 片段移到损伤部

16、位，片段移到损伤部位，提供正确的模板，进行修复提供正确的模板，进行修复分类分类 同源性重组同源性重组 两段双链两段双链DNADNA同源性大于同源性大于200 200 bpbp，大肠杆菌及酵母，大肠杆菌及酵母中中RecRec A A蛋白、人细胞中蛋白、人细胞中Rad51Rad51是关键是关键非同源性重组非同源性重组 同源性低，同源性低，DNADNA双链断裂的主要修复方式，关键双链断裂的主要修复方式，关键分子是分子是DNA-PKDNA-PK及及XRCC4XRCC4，非精确修复，非精确修复372022-5-233838复制中出现损伤重组修复DNA聚合酶填补缺损392022-5-23404041u原核

17、生物利用甲基化区分原核生物利用甲基化区分old old strand strand 和和new strandnew strand，因此原核细，因此原核细胞中的错配修复也称甲基化指导的错胞中的错配修复也称甲基化指导的错配修复（配修复（methyl-directed mismatch methyl-directed mismatch repairrepair）。）。42u错配修复系统识别母链靠错配修复系统识别母链靠DamDam甲基化酶甲基化酶（Dam Dam methylasemethylase），它能使位于），它能使位于5GATC5GATC序列中序列中A A的的N6N6位甲基化。一旦复制叉通过复

18、位甲基化。一旦复制叉通过复制起始位点，母链就会在开始制起始位点，母链就会在开始DNADNA合成前的合成前的一小点时间（几秒钟至几分钟）内被甲基一小点时间（几秒钟至几分钟）内被甲基化。刚合成的化。刚合成的DNADNA新链上的新链上的GATCGATC序列还没有序列还没有来得及甲基化，而作为模板的来得及甲基化，而作为模板的old strandold strand早已被甲基化了，利用这种差别区分早已被甲基化了，利用这种差别区分old old strand strand 和和 new strandnew strand。 4344451. MutSMutS发现错配碱基发现错配碱基2.2.在水解在水解ATP

19、ATP的作用下，的作用下，MutSMutS， MutLMutL与碱基错与碱基错配点的配点的DNADNA双链结合双链结合3.MutS-MutL3.MutS-MutL在在DNADNA双链双链上移动，发现甲基化上移动，发现甲基化DNADNA后由后由MutHMutH切开非甲切开非甲基化的子链基化的子链46错配碱基位于错配碱基位于切口切口33下游下游端端，错配碱基位于错配碱基位于切口切口55上游端，上游端，47（五）（五）SOSSOS修复修复 定义定义 DNADNA损伤时应急产生的修复作用，解除损伤时应急产生的修复作用，解除修复系统抑制，使其产物修复系统抑制，使其产物 ( (多种修复蛋白多种修复蛋白)

20、)参与修复参与修复48SOSSOS修复中修复中LexA-RecALexA-RecA操纵子的作用机理操纵子的作用机理495051v表达表达RecARecA蛋白与这些缺口处单链蛋白与这些缺口处单链DNADNA相结相结合，被激活成蛋白酶。具有蛋白酶活性的合，被激活成蛋白酶。具有蛋白酶活性的RecARecA蛋白将蛋白将LexALexA蛋白切割成没有阻遏作用的蛋白切割成没有阻遏作用的和具有与操纵区和具有与操纵区DNADNA结合活性的两个片段，结合活性的两个片段，导致导致SOSSOS体系的高效表达，使体系的高效表达，使DNADNA得以修复。得以修复。52SOS反应反应 SOS基因基因紫外线紫外线激活激活R

21、ec ALex A阻遏蛋白阻遏蛋白 与与DNA 损伤修复有损伤修复有关的酶和蛋白质关的酶和蛋白质基因基因表达表达Lex A阻遏蛋白阻遏蛋白操纵序列操纵序列DNA5354 DNA DNA 修复的修复的55DNA 损伤在 S 期DNA 损伤在 G1 和 G2 期G1SG2MPOL2RFC5DPB11RAD9RAD17RAD24MEC3MEC1,TEL1RAD5356DNA 损伤P21Gadd 45BaxP53CDK/cyclinGadd45 Gadd45-PCNABlocking cell cycleExcision repairingCell apoptosis57四、DNA损伤应答的研究进展

22、（一）乙酰转移酶（一）乙酰转移酶 T T i i p 6 0 p 6 0在在 DNADNA损伤应答中作用的研究进展损伤应答中作用的研究进展 T T i i p 6 0 ( T a t p 6 0 ( T a t i i n t e r a c t n t e r a c t i i v e p r o v e p r o t e t e i i n ) n ) 是进化上极为保守的乙酰转移酶，是进化上极为保守的乙酰转移酶， 它在细胞周期阻滞、它在细胞周期阻滞、 凋凋亡、亡、D N AD N A损伤修复等众多生理学过程中都发挥着重要的作用。损伤修复等众多生理学过程中都发挥着重要的作用。 作为许多转

23、录因子的共调节因子，作为许多转录因子的共调节因子， T T i i p 6 0 p 6 0 既可以激既可以激活也可以抑制特定基因的转录。当发生活也可以抑制特定基因的转录。当发生D N AD N A损伤时，损伤时， 它被招募到损伤它被招募到损伤位点，位点， 参与参与D N AD N A损损 伤应答的感受、伤应答的感受、 信号转导和修复过程中。信号转导和修复过程中。 除此之外，除此之外， T T i i p 6 0 p 6 0还与许多病理过程有关，还与许多病理过程有关， 尤其是在尤其是在肿瘤发生中起着关键作用。肿瘤发生中起着关键作用。 58 T T i i p 6 0 p 6 0可以可以p 5 3

24、p 5 3依赖和不依赖两种方式参与依赖和不依赖两种方式参与 D N AD N A损损伤应答伤应答：59（二）调控（二）调控 D N AD N A损伤修复基因的损伤修复基因的miRNAmiRNA606162第三节第三节 DNADNA损伤和修复的基因损伤和修复的基因63一、甲基化损伤修复相关基因一、甲基化损伤修复相关基因 甲基转移酶（MGMT）把O6-甲基鸟嘌呤的甲基转移到自身的半胱氨酸残基上，修复甲基化的DNA。 MGMT突变可作为甲基化损伤的基因型标记物。64二、切除修复相关的酶和基因二、切除修复相关的酶和基因尿嘧啶糖基化酶为主要的始动因素，可作为DNA损伤的生物标记物。大肠杆菌Uvr基因家族

25、、人ecrr基因和切除修复基因等65三、错配修复相关基因三、错配修复相关基因MSH2、MLH1等蛋白参与错配修复，而错配修复的缺陷往往是癌变的第一步。错配修复基因：Muthls系统、人类的hmsh2/3、hpmsl1/2、Mutsa、msh6。错配修复基因的微卫星序列的不稳定性 （microsatellite instability， MI）66四、四、 DNADNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶参与辐射损伤和化学损伤的修复，并对细胞的生长具有调节作用。 DNA聚合酶 的突变可导致碱基切除修复功能的缺陷。67五、五、 DNADNA加合物加合物 英文名称：DNA adduct 定义：DNA分子与化学

26、诱变剂间反应形成的一种共价 结合的产物。这种结合激活了DNA的修复过程。 如果这种修复不是发生在DNA复制前，会导致核 苷酸的替代、缺失和染色体的重排。 DNA加合物可作为DNA损伤的暴露标记物和效应标记物，其去除的速度也可作为DNA修复功能的生物标记物。68DNADNA损伤和修复的生物学意义损伤和修复的生物学意义 避免基因组的不稳定性、癌症和细胞死亡是至关重要的。 DNA修复途径可以识别和修复特异的DNA损伤，保证生物物种的遗传稳定性。69第四节 与DNA修复有关的人类遗传疾病着着色性色性干干皮病皮病(Xeroderma pigmentosum) 布布伦伦氏症候群氏症候群(Blooms syndrome) 遗传遗传性大性大肠肠癌癌(Hereditary nonpo