基因工程总结

1、PDF1CTAB法(植物DNA提取的经典方法)§原理CTAB（cetyltrimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；Ø EDTA-2Na 螯合Mg离子，抑制DNase

2、（DNA酶）活性；Ø NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；Ø CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；高盐溶液中可溶Ø - 巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 酚氯仿：使蛋白质变性，抽提液分相，苯酚又可抑制DNA酶的降解作用，氯仿可以去除RNA酶。 异戊醇：降低张力，消除泡沫乙醇：能与水以任何比例互溶，在抽提液中与DNA争夺水分子（脱水），使DNA分子沉淀出来TE溶液，溶解DNA，提供缓冲环境，保存DNA植物材料、液氮研磨、细胞裂解、裂解液、抽提、上层溶液、酒精沉淀、离心洗涤、干燥溶解、DNA溶液材料准

3、备：基因组DNA 新鲜材料，低温保存，避免反复冻融。血液基因组DNA提取选择有核细胞（白细胞）。细胞培养时间不能过长。含病毒的液体材料提取前先富集。细胞裂解：材料过多影响裂解，导致DNA量少，纯度低。针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶K 细 菌溶菌酶破壁 酵 母破壁酶或玻璃珠核酸分离纯化：采用吸附材料吸附分离DNA，应提供相应的缓冲体系。采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀。离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法。蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂（SDS、

4、异硫氰酸胍等） 蛋白酶处理§ 多糖的去除： 多糖水解酶 在提取缓冲液中加1/2体积氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA多酚的去除： 加入还原剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等。 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG，可防止酚类与DNA的结合。§ 盐离子的去除： 70的乙醇洗涤核酸沉淀预冷的乙醇或异丙醇更能充分沉淀。 加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀。晾干DNA，让乙醇充分挥发。 核酸溶解保存若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。pH值为8.0，可防止DNA发生酸解DNA提取常见问题分析一：

5、DNA降解原因：1提取操作过于剧烈，DNA被打断2. 外源核酸酶污染3. 材料不新鲜、反复冻融或细胞衰老方法：1. 低温保存，避免反复冻融。2. 液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入裂解缓冲液。3. 增加裂解液中螯合剂的含量。4. 细胞裂解后操作应尽量轻柔。5. 试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。6. DNA分装保存于缓冲液，避免反复冻融。常见问题分析二： DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因：1. DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2. DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3. DNA中残留有金属离子方法：1. 重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）。

6、2. 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发。3. 增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）。常见问题分析三：DNA提取量少原因：1. 实验材料不佳或量少2. 破壁或裂解不充分3. 沉淀不完全4. 洗涤时DNA丢失方法：1. 尽量选用新鲜（幼嫩）的材料。2. 动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。3. 高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）。4. 低温沉淀，延长沉淀时间。5. 加辅助物，促进沉淀。6. 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒。RNA提取过程中的关键点细胞或组织的有效破碎，有效地使核蛋白复合体变性，抑制RNA酶的活性，从RNA和蛋白混合物中分离

7、RNA，去除其它杂质，如多糖，无机盐RNA提取常见问题分析A、样品不纯：1. 蛋白 2. 多糖多酚 3. DNA 4. 离子1. 保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心2. 增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化3. 减少处理样品的量4. 加入不含RNase的DNase处理；再次纯化B、得率不高：1.样品太多或太少2.RNA在柱子上未洗出3.洗出液中有酒精1. 减少或增加样品使用量2. 加入RNase Free, 放置几分钟再离心3. 漂洗后再次离心C、降解、1样品不新鲜或保存不当2. RNase污染3. RNA溶液储存不当1. 取新鲜的样品；取样后立即放入液氮或储存液保存2. 研磨样品及时补充

8、液氮3. 严格处理相应的器具和试剂4. -70 冻存，分装使用具体操作步骤（CTAB法）1、剪取植物幼叶0.2g，在液氮(-196)下研磨成粉末状2、迅速加入600l 经65水浴预热的2%CTAB抽提缓冲液3、转入2ml离心管中，65水浴3045min，期间不时摇匀4、加入300l Tris-饱和酚与300l氯仿/异戊醇(24:1)，剧烈振荡30s5、室温12,000 rpm离心10min ，将上清液转到新的离心管中加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，温和地混匀6、室温12,000 rpm离心10min ，将上清液转到新的离心管中7、加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)和2倍体

9、积冰冷的无水乙醇8、-20放置30min，4、12,000rpm下离心10min，倒掉上清液9、沉淀分别用70%乙醇和无水乙醇各洗涤一次，室温下风干10、加入200l双蒸水，获得DNA粗提取液，可进行PCR检测各步骤的作用1、 在液氮(-196)中研磨植物组织，易于破碎，并可抑制细胞中各种酶类的作用。植物细胞匀浆中的多种酶类(尤其是氧化酶类)会对DNA的抽提产生不利影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇，即2-ME)以降低这些酶类的活性。十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)等离子型表面活性剂能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核

10、蛋白解聚，并使DNA游离出来。2、 苯酚、氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性，并使抽提液分相。核酸(DNA、RNA)的水溶性很强，不溶于苯酚/氯仿，在水溶液中加入苯酚/氯仿，经离心后分为上下两层，可从上层水相中将核酸溶液分离出来。§ 低温、乙醇或异丙醇可使上清液中的核酸沉淀下来(有些方法则使用玻璃珠(SiO2微粒)来吸附DNA)，溶于水或TE溶液中，得到总RNA抽提产物。必要时还可加入RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，由此，可得到较纯的植物总DNA制剂。注意事项1、在提取过程中，植物细胞的染色体易发生机械断裂，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿

11、抽提次数，混匀过程要轻缓, 以保证得到较完整的DNA。2、在抽提过程中，植物组织中的酚类物质易发生氧化，使抽提液发生褐变，而多糖会在DNA沉淀时形成粘绸状物，这不仅对DNA抽提产生严重影响，还对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用。因此，从富含多糖和酚类物质的材料中提取DNA时, 应考虑将其去除。3、利用基因组DNA较长的特性，可将其与细胞器小分子DNA进行初步分离。在抽提液中加入一定比例的异丙醇或乙醇，可使小分子DNA形成颗粒状沉淀粘附于离心管壁及底部，而大分子的基因组DNA即会团积成块(絮状)，飘浮于抽提液中，此时可用玻棒将其挑出。PDF2¨电泳，是指带电荷的供试品（蛋白质、

12、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量的方法。影响电泳迁移率的因素电场强度、溶液的pH值、缓冲液离子浓度、电渗指示剂：电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程，这种物质叫做指示剂。常用的指示剂有两种：溴酚蓝（bromophenol blue，Bb）呈篮紫色；二甲苯青（xylene cyanol，Xc）呈蓝色。染色剂：电泳后，核酸须经过染色才能显示出带型。这种用于染色的物质叫做染色剂。在波长260 nm的紫外线下，1

13、 OD值的光密度相当于双链DNA 50g /mL，单链DNA为33g /mL，RNA为40g /mL，以此来计算核酸样品的浓度。dsDNA=50×OD260×稀释倍数(g /mL)ssDNA=33×OD260×稀释倍数(g /mL)PDF3基因是编码蛋白质或RNA分子遗传信息的基本遗传单位。基因是一段具有特定功能和结构的连续的DNA序列，是构成巨大遗传单位-染色体的重要组成部分。基因克隆的基本程序：目的基因的获得，目的基因的回收，克隆载体的构建（载体和目的基因的连接），连接产物对宿主感受态细胞的转化，阳性转化子的筛选，质粒的抽提，阳性重组子的鉴定，阳性转

14、化子的获得把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化(Transformation)。把外源DNA分子导入到某一宿主动物细胞的过程称为转染(Transinfection)。转化后的受体细胞能够获得新的遗传性状，称为转化子。即带有异源DNA分子的受体细胞 。感受态细胞(Compenent cells)。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，能允许外源DNA分子进入，这种易于吸收外源DNA的细胞称为感受态细胞(Compenent cells)。化学法原理：在冰冻的氯化钙溶液中，细菌细胞膨胀成球形，而外源DNA形成羧基-钙磷

15、酸复合物(具抗DNase的能力)粘附于细胞表面，经42短时间热击处理，细胞可以吸收外源DNA。化学法（CaCl2）制备感受态细胞的操作步骤1、 取-70保存的E. coliJM109的菌种划板；2、从LB平板上挑取新活化的JM 109单菌落，接种于35ml LB液体培养基中，37下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期；3、将该菌悬液以1:501:20的比例接种于100 ml LB液体培养基中，37振荡培养若干小时，至菌液的OD600 为0.40.9；4、取新鲜培养液1.5 ml转入eppendorf管中，冰上放置10分钟，然后于4下4000 rpm离心10分钟，小心弃上清。重复一次，收集菌体

16、。用灭菌滤纸条吸尽残液。5、加入冰预冷的0.1 mol/L CaCl2 溶液300l轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟后，4下4000 rpm离心10分钟，弃去上清。6、沉淀加入100l预冷的0.1mol/L CaCl2 溶液轻轻悬浮细胞，即为感受态细胞，1224小时后立即使用。保存：如果感受态细胞需贮存以后再使用，则加入30l预冷的含50%甘油与70l的0.1mol/L的CaCl2溶液（甘油终浓度为15），置-70保存(可保存半年)感受态细胞制备过程中的注意事项1、细胞的生长状态和密度2、所用试剂的质量3、要严格防止杂菌和杂DNA的污染4、受体菌细胞经CaCl2处理后，细胞较脆，悬浮时需小心操作

17、。PDF4聚合酶链式反应简称PCR技术，是近年发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异DNA序列的拷贝。大大简化了传统的分子克隆技术，使得对目的基因的分析、鉴定变得较为容易。PCR技术的基本原理：PCR模拟DNA的天然复制过程，在试管内创造合适的条件，以给定的DNA为模板，以恰当的寡聚核苷酸为引物，以四种脱氧核糖核苷酸为底物，由DNA聚合酶催化特定DNA链进行合成（扩增）。引物二聚体是PCR过程中因引物之间3端的相互配对而引发的两引物互为模板的合成产物。引物二聚体的形成对目的分子的扩增效率会形成干扰，因此引物设计时要尽量避免两引物之间或一引

18、物分子之间有过多的互补碱基，尤其是3端不能多于4个碱基互补。 3端有二级结构（发夹结构）的引物是不能有效引发延伸的，因此设计时要加以避免。当温度升高到一定值后，双链DNA分子会解链为单链，这种温度称为解链温度。Tm值是指溶液中有半数的DNA分子解链为单链时的温度。反向PCR（inverse PCR）：常规PCR的扩增片断是位于已知序列的两个引物之间；反向PCR则可以对一个已知DNA片断两侧的未知序列进行扩增和研究。RACE（rapid amplification of cDNA ends）PCR：特别适用于扩增那些已知部分序列的真核生物的目的基因。RACE法又可分为5RACE和3RACE法。如

19、果已知部分的cDNA序列，就可以以已知的碱基序列为基础进行PCR，扩增至cDNA的两个末端。如果未知区域是mRNA的上游区域即5 ，端，则称为5，RACE；如果是mRNA下游的3 ，端，则称为3,RACE。多重PCR（multiplex PCR）同一个试管中加入多对引物，扩增同一模板的不同区域片断。巢式PCR:当模板的量极低，或者模板不纯时，通常未能扩增出PCR产物。此时，一种解决的方法就是将反应后没有产生PCR产物的溶液按1：100稀释到新的反应混合物中，再进行30轮循环。重组PCR的定点诱变技术: 在PCR基础上，运用重叠延伸方法将突变序列引入PCR产物的中间部位。此方法需要一对内部致突变

20、引物和一对侧翼引物，需要经过3次PCR反应。PDF5回收DNA片断应该注意的事项：选择恰当的回收方法，提高DNA的上样量，减少DNA回收时的定容容积硅胶膜回收技术原理（试剂盒法）基本原理高温使含DNA的凝胶融解，在有NaI 、NaCLO4存在的情况下，在高的离子强度和低pH值条件下，经过改良的SiO2颗粒能够可逆地吸附DNA分子，在有乙醇等DNA沉淀剂存在的条件下用洗液将体系中的杂质洗除，最后在低离子强度和高pH值条件下，用双蒸水或TE将DNA从SiO2颗粒上洗脱下来。DNA分子的连接策略A 、两个具有互补黏性末端的DNA片段的连接v分别用两种不同的限制性内切酶来切割载体和目的基因，可以产生互

21、补的粘性末端。两个这样的片断进行连接，是最容易成功的。B、两个具有相同黏性末端的DNA片段的连接v由同一种内切酶或不同的内切酶切割体和目的基因，都可以产生相同的黏性末端。v两个这样的片断进行连接，可能产生两个负面结果：载体自身环化和目的基因的不定向插入。自身环化问题可以通过加入碱性磷酸酶去“P”加以解决C、 两个具有平末端的DNA片段的连接理论上任何一对具有平末端的DNA分子都能在T4DNA连接酶的催化下进行连接。这给不同DNA分子的连接带来极大的方便。D、两个具有非互补黏性末端的DNA片断的连接分别用两种不同的限制性内切酶来切割载体和目的基因，可以产生带有非互补的粘性末端。两个不能互补的黏性

22、末端不能直接相连，此时可以采取两种法。a 将黏性末端修饰成平末端，然后再进行连接。b 将一个黏性末端部分补平，再连上一个接头（即DNA连接子），其中含有与另一个黏性末端互补的酶切位点序列。将之酶切后，与另一端进行连接。E、 一个为平末端，另一个为黏性末端进行连接（DNA连接子技术）当两个要连接的片断一个为平末端，另一个为黏性末端时，可以考虑使用DNA连接子技术。DNA连接子：是人工设计合成的一段具有平末端的双链DNA序列。其中含有一个或多个限制性内切酶位点，一般大小为812 bp。DNA连接子的作用主要是在DNA的平末端添加新的内切酶位点以产生黏性末端，便于DNA片断之间的连接。关于定向克隆使

23、外源DNA片断定向插入到载体分子中的方案叫定向克隆。它是利用DNA分子两端的不同酶切位点进行的，它能有效限制载体DNA的自身环化，降低非重组子的背景。定向克隆要求载体DNA分子两端不能互补，只能与外源DNA分子的相应末端连接。PCR 产物的特点 Taq 系列的 DNA 聚合酶在进行 PCR 反应时能在大多数双链 DNA 产物的 3端都加上一个非模板依赖的悬挂的 A，使 PCR 产物相当于两端有突出 A 的粘性末端分子。T-载体 对克隆载体合适位点进行单酶切，再在两侧的 3端添加一个悬挂的 T 即成PDF6转化的概念：在基因克隆技术中，转化（transformation）特指质粒DNA或以它为载

24、体构建的重组子导入细菌的过程。转化后的受体细胞能够获得新的遗传性状，称为转化子即带有异源DNA分子的受体细胞)。阳性转化子的筛选：目的基因进行克隆的最后一道工序就是从转化细菌的单菌落中筛选含有阳性重组质粒的菌落并鉴定重组质粒的正确性。然后通过细菌培养以及重组子的扩增，从而获得所需基因片断的大量拷贝，进一步研究该基因的结构、功能或表达该基因的产物。不同的载体及相应的宿主系统，其转化子的筛选和重组质粒的鉴定方法不尽相同。v筛选阳性转化子的主要方法1 针对遗传表型发生改变的筛选法（必需）：抗生素平板筛选（必要）2 -半乳糖苷酶系统筛选法（非必需）3 抽提转化细胞中的质粒，鉴定其是否为重组子（必需）：

25、蓝白斑筛选。鉴定重组子的方法分析其结构特征快速裂解菌落，抽提质粒，鉴定其分子大小是否与预期相符（非必需，初步筛选，还需要PCR及酶切的证据）PCR筛选重组子（非必需）内切酶图谱鉴定（必需）菌落（噬菌斑）原位杂交（非必需）Southern印迹杂交（非必需）我们的实验要做那些检测？抗生素平板筛选（初步筛选转化子）蓝白斑筛选（初步筛选转化子）特异引物PCR 验证（筛选重组质粒的非必要证据）双酶切验证（筛选重组质粒的必要证据）转化子：指细菌的单菌落重组子：指含有目的基因的重组质粒蓝白斑筛选的原理：在各自独立的情况下, 载体和宿主细胞编码的-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但它们融为一体时可形成具有酶活性

26、的蛋白质。这种lac Z基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现象叫-互补。 v 由-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物Xgal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)的存在下被诱导物IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。 当外源片段插入到质粒载体的多克隆位点上后会导致原本读码框架的改变, 使表达蛋白失活。最终导致产生的氨基酸片段失去-互补能力。因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。PDF7质粒(Plasmid)是细菌菌体内染色体外的一种环状DNA分子，是一种稳定的遗传因子，它

27、可以独立于细菌染色体DNA而复制；并且赋于宿主细胞一些特异的表型，如对抗生素的抗性等。在质粒载体上进行基因克隆的基本步骤1、先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段 2、在体外构建连接反应，使两者相连接3、用所得的连接产物转化宿主细菌感受态细胞4、对所得的候选单菌落进行培养，抽提其中的质粒，经过鉴定，选出带有外源基因的重组质粒。理想的质粒载体应有的特性：分子量小、多拷贝的松驰型 具有多种常用的限制性内切酶的单一切点l 能插入较大的外源DNA片段 具有容易操作的检测表型分离质粒DNA的基本步骤：培养细菌使质粒扩增 收集和裂解细菌细胞 分离和纯化质粒DNA碱裂解法提取质粒DNA的基本原理：在

28、pH值为12.012.6的碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA发生变性，而共价闭合环状的质粒DNA仍为自然状态。将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可将去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核酸分子的多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶，其产生的DNA片断5，端为磷酸根，3端为OH.酸限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子

29、中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。同裂酶（isochizomers）：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。同裂酶的切割位点可能不同，识别序列和切割位点都相同的叫同序同切酶，识别序列相同但切割位点不同的叫同序异切酶。同尾酶（isocaudamer）：这是与同裂酶对应的一类限制性内切酶。来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后都产生相同粘性末端的限制酶叫做同尾酶切刻内切酶（nicking endonuclease ）一些特殊的核酸限制性内切酶，它们只水解双链DNA中的一条链，对DNA链进行切刻而不是切断归位内切酶（Homing endo

30、nuclease ）一种能识别较长的非回文序列（1240 bp）的双链DNA核酸酶，其编码序列位于内含子或内含肽中星号活性限制性内切酶在非标准反应条件下，能够切割一些和其特异识别序列类似的序列，这种现象叫星号活性诱发星号活性出现的常见原因：内切酶用量过大（100 U/µg DNA），导致酶切体系中甘油含量过高(5%,V/V)； 酶切体系中离子强度过低（25 mmol/L）；酶切体系pH值过高（pH 8.0）；o 酶切体系中含有有机溶剂；含有非Mg2+的二价阳离子存在。防止星号活性产生的措施：尽量使用在一定时间内能达到完全切割底物DNA的最小酶量，以减少体系中甘油的含量；尽量避免反应混

31、合物中存在有机溶剂；将反应混合物中离子强度提高到100 mmol/L150 mmol/L；o 酶切体系pH值降低到7.0；只用Mg2+作辅助因子，排除其他二价阳离子的存在。实验七分析为什么我们的培养皿上有很多非正常菌落（背景不干净）？可能原因：污染严重，有很多杂菌。培养时间过长，细菌会产生一些酶，降解Amp，使得非转化子的单菌落也长出来，这种菌落叫卫星菌落。菌液太浓，涂的太密，有些菌落接触不到Amp，也会长出卫星菌落。受体细菌传代的代数过多，细菌发生退化和变异。应对措施：o 涂完菌液后，平板一定要先正放，等菌液完全干后，再倒置培养；否则，易出现卫星菌落。o 涂布棒要灭菌后再使用，一定要晾凉，否

32、则容易烫死细菌。受体菌传代数不要过多PDF8主要内容1、表达质粒的构建2、外源基因的诱导表达3、表达蛋白的SDS-PAGE分析4、原核表达蛋白的分离与纯化表达质粒的构建§表达载体（express vector）是指结构中带有在某种宿主细胞内进行基因表达所需的调控序列，能使克隆的基因在宿主细胞内进行转录与翻译的载体。表达载体有原核细胞表达载体、真核细胞表达载体；植物细胞表达载体、动物细胞表达载体等之分。构建表达载体时要注意的因素正确的阅读框架。目的基因进行有效转录的启动子。转录终止子。mRNA进行有效翻译的SD序列 （原核表达载体）。使外源基因在转录、翻译后进行适当修饰和加工的相关元件

33、。相关信号序列原核表达1、获得目的基因2、准备原核表达载体3、将目的基因插入表达载体中重组表达质粒的构建（构建成功与否需要测序来证实）4、表达质粒转化相应的宿主表达菌及阳性转化子的筛选5、外源基因的诱导表达（诱导靶蛋白进行表达）6、表达蛋白的分析浓缩效应：在不连续缓冲系统中，样品在进入分离胶以前，先经过大孔径浓缩胶的迁移作用而被浓缩至一极窄的区带。外源基因在细菌中高效表达获得的表达蛋白，通常在细菌细胞内凝集成为没有活性的固体颗粒，即包涵体。一般的水溶液很难溶解包涵体，只有在加有变性剂(如盐酸胍、脲)的溶液中才能很好溶解。获得有生物活性的原核表达蛋白的主体思路1、诱导表达 裂解细胞 收集细胞里的

34、总蛋白 SDS-PAGE 如有特殊表达的蛋白条带，再往下做2、分别取表达菌的培养液上清和裂解液的沉淀进行SDSPAGE 判断表达蛋白是否可溶3、如果可溶，大量表达目的蛋白，进行下一步的功能测试4、如果不可溶，即为包涵体。需要先设法将包涵体复性，再进行下一步的功能测试PDF10核酸的分子杂交:指非同一来源但具有互补序列的两条核苷酸链，通过Watson-Crick碱基配对形成稳定的双链分子的过程。若其中一条链被人为标记，该标记可通过某种方法检出，即成为所谓的探针。探针与互补的核苷酸链杂交后，杂交体也被带上同样的标记，可被检测出来。Southern杂交：是以DNA或RNA为探针，检测DNA链，用于鉴

35、定基因的存在或整合。Northern杂交：是以DNA或RNA为探针，检测RNA链，用于鉴定特定基因转录的特异mRNA。印迹杂交：1 将DNA分子进行限制酶消化（ Southern杂交需要，Northern杂交不需要）2 凝胶电泳分离3、转移到固相膜上4、加入探针，与固相膜上的特异片断进行杂交斑点（dot）或狭缝（slot）杂交1、将核酸样品直接点在固相膜上2、加入探针，与相膜上的特异片断进行杂交细胞原位（in situ）杂交：包括菌落原位杂交和真核细胞原位杂交菌落原位杂交：将菌落或噬菌斑转到固相膜上，原位裂解细胞后使细胞固定在膜上，然后进行杂交。真核细胞原位杂交：用探针与固定在载玻片上的或组织

36、切片内变性的DNA或RNA进行杂交。探针是指经特殊化合物标记的的特定的核苷酸或蛋白质序列。Southern杂交的种类Southern斑点杂交可较快的、大略检测一下基因组中是否含有某种基因。这种方法的主要问题是假阳性率较高。Southern印迹杂交可清晰而准确的显示特异杂交体的数量及位置（确定是否含有目的基因，分析其整合情况如拷贝数等方面），是可信度最高的一种方法。Southern印迹杂交流程特定基因转录的Northern杂交分析可检测目的基因的转录水平，是研究基因表达调控的重要手段。Northern杂交的基本程序植物细胞总RNA的提取探针的制备及标记印迹及杂交结果分析Northern斑点杂交的

37、基本程序：材料的预处理；材料总RNA提取；将实验样品稀释，点在固相膜上，设立阴阳性对照；膜与不含探针的杂交液温育，以封闭非特异性位点；探针的制备；加入经变性处理的探针，进行杂交；根据标记物质进行捡出；分析杂交结果，通过与阳性对照比较来估计外源基因表达量Northern印迹杂交的基本程序与Southern印迹杂交相比，只有第一步总RNA或mRNA的变性电泳分离有较大不同，其余步骤与之相同 关于RNA的变性凝胶电泳特定基因表达蛋白质的检测基因编码的蛋白在转基因生物中能正常表达并最终表现出应有的功能是基因转化的最终目的表达的特异蛋白质应具有一定的稳定性，不被细胞内的蛋白酶降解，同时应对植物细胞无毒性

38、。基因表达蛋白质检测的主要方法利用免疫学原理，ELISA和Western杂交是经典方法。ELISA检测 ELISA是酶联免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay）的简称。是一种利用免疫学原理检测抗原、抗体的技术ELISA检测的基本程序特异抗体的制备待检抗原或抗体的包被加入特异抗体，与包被的抗原发生免疫反应阳性样品的检出Western杂交 Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的蛋白质检测方法。 利用抗原抗体特异结合的原理，检测外源基因表达的蛋白质的存在。灵敏度很高（15 ng）。据检测结果，可知细胞内目的蛋白表达与否，浓度大小及大致的分

39、子量。Western杂交程序 细胞内蛋白质的提取 SDS-PAGE分离蛋白质 蛋白质条带印迹 探针制备 杂交 结果捡出Western杂交固相膜的种类硝酸纤维素膜重氮化纤维素膜阳离子尼龙膜 PVDF膜Western杂交的印迹方法电印迹法目前最多采用被动印迹法PDF11什么是基因克隆的载体？为了得到目的基因的大量拷贝，就必须将其连接到一种在特定系统具备自我复制能力的DNA分子上去。 这种DNA分子就是基因克隆载体。载体在基因工程中扮演着一个十分重要的“交通运输工具”的角色。基因克隆载体的功能载体DNA分子是细胞内非染色体的遗传物质，本身就是复制子，它能载着外源基因进入新的寄主细胞内，使不具有复制子

40、的外源基因进行复制，并在寄主细胞内很好地转录甚至表达出特定的基因产物基因克隆载体系统的类型§ 载体类型多种多样。在基因工程发展初期，所用的载体都是在天然质粒的基础上改建成的。§ 目前已构建了大批不同类型的载体，包括：细菌质粒载体；噬菌体载体；柯斯质粒载体等。§ 另外，还包括一些有特殊用途的载体，如各种表达载体等。细菌质粒载体细菌质粒的一般生物学特性：细菌质粒的结构非常简单，没有细胞结构。§质粒存在于细胞质中，独立于染色体外。它是由环形的双链DNA组成的复制子。§它可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，只有在寄主细胞内进行一定程度的独立复制，并随

41、着寄主细胞的分裂而被遗传下去。载体质粒的基本特征凡作为基因克隆的载体质粒，必须具有：复制起始位点克隆位点选择标记实例说明，植物基因工程载体的构建过程具体操作步骤1、抽提供体质粒和载体质粒DNA§ 分别抽提pUC57-sCT和p35S-2300-hFIX的质粒。2、酶切：用BamH和Sac对pUC57-sCT和p35S-2300-hFIX的质粒进行双酶切，分别回收酶切后p35S-2300-hFIX约10kb的大片段和pUC57-sCT的112 bp的小片断。3、连接、转化§ 将10kb的大片段和112 bp的小片断用T4 DNA 连接酶在16连接过夜；然后转化大肠杆菌DH5的

42、感受态细胞；经筛选培养，获得候选的转化子。随机挑取12个分离良好的转化子单菌落，接种于液体LB（Kan+=50 mg/L）。抽提其中的质粒，用PCR检测和双酶切对所选重组子进行鉴定，筛选得到阳性重组子。进而筛选得到阳性转化子。4、载体测序鉴定对于要在宿主细胞中进行表达的基因，为了慎重起见，要求对所构建的表达载体进行测序（对插入片段进行测序）。 得到携带序列正确的表达载体5、表达载体导入农杆菌（冻融法）6、在转化农杆菌后的筛选平板上随机挑15个单菌落，抽提其质粒，进行PCR检测7、将所筛选的农杆菌阳性转化子（即所谓工程农杆菌）的菌液与受体植物的外植体共培养PDF12：外源基因转化植物的受体系统的建立转基因技术的定义：转基因技术就是将人工分离和修饰的基因导入到目的生物体的基因组中；当转入的基因整合到染色体上或基因组中以后，这些基因就会与寄主生物的遗传物质一起向子代传递，并产生应有的生物学功能，从而达到改造生物的目的。目的基因转化植物的基本步骤n植物基因表达载体的构建（构建表达载体