基因工程与应用

1、基因工程与应用课程设计题目： 花香基因重组改善宠物体味 姓 名： 张超 学 号： 201004030122 班 级： 药物制剂122班 指导教师： 张雯 2015 年 5 月 9日在狗胚胎中导入花香基因改善宠物体味一、 绪论转基因技术是近年来研究最热门 、发展最快的领域之一 。所谓转基因动物就是指用试验的方法将人们所需要的外源基因导入到动物体内 , 使这种外源基因与动物本身的染色体整合在一起 , 这样外源基因就能随着细胞的分裂而增殖 ,在动物体内得到表达 , 并且能够稳定遗传给后代的动物 。转基因动物自产生以来 , 随着研究的不断深入 ,近些年来得到了迅速的发展 。由于它打破了自然繁殖中的种间

2、隔离 ,使基因能在种系关系很远的机体间流动 , 实现了动物种间遗传物质的交换与重组 ,这不仅为遗传物质的研究提供了新的手段 ,丰富了物种的基因库 , 而且扩大了生命科学的视野 。宠物是人类的好朋友。它不仅能帮助人们解闷，还对人体健康具有重要作用。美国“网络医学博士网”列举了宠物改善健康的27种好处。其中包括调节情绪，减轻压力；稳定血压；降低胆固醇；有益心脏；治疗抑郁；有益健身；促进血液循环，降低中风危险；促进主人们之间的人际交往，减少孤独；减少孩子过敏症，增强免疫力；用于诊所和养老院有助于改善老年人以及患者情绪等等多种好处。但在养宠物特别是猫猫狗狗的过程中我们能感受到，宠物身上的异味让很多爱猫

3、爱狗人士苦不堪言 ，主人们想尽办法减轻宠物体味：定期洗澡、选择清新体味的浴液甚至狗狗专用香水，但这也只能解决一时之需。随着生活节奏的逐步加快，最需要养宠物缓解压力的人群却往往没有时间打理宠物，导致很多人不得不放弃饲养宠物而失去一个改善健康提高生活质量的机会。这一问题给基因工程的研究提出一个新思路，我们可以通过将控制花香的基因导入宠物受精卵中，调节控制花香基因的表达，使猫狗等天生便带有体香，使更多需要宠物的人愿意去养宠物，使人类更加健康，社会更加和谐。现以茉莉花香基因导入狗体内进行表达为例。二、设计过程： 2.1.提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。以双瓣茉莉花瓣为材料，采

4、用 RT-PCR（逆转录PCR） 和 RACE（cDNA末端快速克隆） 技术相结合的方法，获得茉莉花香气形成限速酶，即5磷酸脱氧木酮糖合成酶（Deoxyoxylulose-5-phosphate synthase，DXS）基因（命名为 JsDXS）。1、首先采用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取茉莉花瓣总RNA，以总RNA为模板合成双链cDNA。根据已报道的丹参、连翘、金等 DXS 基因序列，用 DNAMAN 设计出保守区简并引物；DXS-R：5-TGGGA(T/C)GT(C/T)GG(T/C)CA(C/T)CAG(G/T)(C/T)-3DXS-F：5-GC(T/C)TC(G/A)TC

5、(A/T)GA(A/T)GGAGCCAT-3PCR 扩增体系： dNTPs，模板，引物 DXS-R， 引物DXS-F，Ex-Taq 酶，MgCl2 95 预变性 5 min，95 变性 30 s，53 退火 45 s，72 延伸 90 s，35 个循环，最后72 延伸 10 min 进行 PCR 扩增。2、根据保守区克隆结果分别设计特异性 5RACE 和 3RACE 引物5-DXS：5-AGTAGTTCGTGTATGACTGAGTTGGTGC-33-DXS：5-CATGCAAAGGGCTTATGACCAGGTAGTGC-3 退火温度提高至 55 进行 PCR 扩增。将获得的全长 cDNA，在其

6、 ORF(开放阅读框)两端设计特异引物扩增全长序列。将保守区、5RACE 和 3RACE 序列拼接，得到茉莉花 DXS 基因 cDNA 全长 2505 bp。包含1个完整的阅读框（232 2 380 bp），编码 714 个氨基酸，该基因含有起始密码子 ATG、终止密码子TAA、16个A的PolyA 尾巴和AATAAA 加尾信号，并含有保守功能结构域。2.2. 表达载体的构建选用逆转录病毒(retrovirus,RV)载体，逆转录病毒载体与其他用于真核表达的载体相比，具有以下优点: ( 1) 逆转录病毒寄主范围广泛; ( 2) 逆转录病毒具有强启动子，能够高效稳定表达外源基因; ( 3) 具有

7、很高的病毒滴度及转染效率， 且不会致死寄主细胞; ( 4) 对宿主细胞没有毒副作用; ( 5) 可以携带较大的目的基因; ( 6) 只能感染分裂细胞( 7) 大多数情况下，其携带基因能够在正常的细胞中转录。逆转录病毒经寄主细胞表面的受体蛋白识别后进入细胞,然后在自身基因组编码的反转录酶的作用下,以基因组RNA为模板反转录出双链DNA。双链DNA能够随机整合到寄主细胞的染色体上,随着寄主细胞的复制而复制。基因组由3个结构基因gag、pol和env构成,两侧有长末端重复序列(long terminal re-peat,LTR)。去除LTR及包装信号序列(psi-site)外的所有基因,插入启动子和

8、抗性基因（氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因）, 利用限制性核酸内切酶切开插入的氨苄青霉素抗性基因，将茉莉花JsDXS基因导入已经被酶切开的青霉素抗性基因缺口处；利用T4连接酶对载体和目的基因进行连接；将重组的RV利用影印得到含有JsDXS基因的重组载体,包装病毒所需的结构蛋白则由辅助病毒提供。利用抗生素抗性基因插入失活法实现含有目的基因的重组载体的筛选。2.3.将目的基因导入狗胚胎细胞内直接将狗胚胎细胞与能释放反转录病毒的单层培养细胞共孵育,通过病毒将目的基因插入 ,随着病毒 DNA的整合,目的基因也整合到靶细胞基因组并进行表达,完成基因转移。再将带有JsDXS基因的胚胎移植到怀孕的或假孕的

9、雌性狗体内。2.4.目的基因的检测和表达对于子代动物有可能并不会表达出外源基因，需要我们在构建胚胎宿主细胞的时候可以大规模多数量进行。对出生的幼畜进行基因整合表达的检测，把筛选出来的转基因动物繁殖传代培养，然后就可以建立转基因种群的大量繁殖，即可生产带有茉莉花体香的宠物狗。参考文献（1）、茉莉花香气相关基因 JsDXS 及其启动子的克隆与表达分析 孙君，陈桂信等 园艺学报 2014，41（6）：12361244 （2）、植物花香代谢调节与基因工程研究进展 赵印泉、周斯建等 热带亚热带植物学报2011，19( 4):381390（3）、基因治疗的病毒载体系统 张婵,邵艳军 生物技术BIOTECHNOLOGY第17卷第1期:902007年2月（4）、逆转录病毒载体及其在动物病毒病的