基因工程的基本操作程序(修改版)

1、1.2 1.2 基因工程基因工程基因工程又叫做基因工程又叫做基因拼接技术基因拼接技术或或DNADNA重组技术重组技术。通俗地说，就。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生是按照人们的意愿，把一种生物的某种物的某种基因基因提取出来，加以提取出来，加以修饰改造修饰改造，然后放到另一种生，然后放到另一种生物的细胞里，物的细胞里，定向地定向地改造生物改造生物的遗传性状。的遗传性状。DNA 重组技术的基本工具重组技术的基本工具 1 DNA1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具专题一专题一 基因工程基因工程“分子手术刀分子手术刀” 限制酶限制酶 “分子缝合针分子缝合针” DNA连接酶连接酶 “分子

2、运输车分子运输车” 基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 粘性末端粘性末端平末端平末端 限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列有什么特点？ 限制酶所识别的序列，无论是限制酶所识别的序列，无论是6 6个碱基还是个碱基还是4 4个碱个碱基，都可以找到一条中心轴线基，都可以找到一条中心轴线, ,中轴线两侧的双中轴线两侧的双链链DNADNA上的碱基是反向对称重复排列的。上的碱基是反向对称重复排列的。图图1-1 1-1 限制酶识别序列的中心轴线限制酶识别序列的中心轴线 迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的是从细菌

3、或霉菌中提取出来的. . 细菌中限制酶之所以不切断自身细菌中限制酶之所以不切断自身DNADNA，是因为微，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的机制，对于外源入侵的DNADNA可以降解掉。生物在可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其其DNADNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者所识别序列被修饰或者所识别序列被修饰。这样，尽管细菌中含有。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的某种限制酶也不会使自身的DNADNA被

4、切断，并且可被切断，并且可以防止外源以防止外源DNADNA的入侵的入侵 1、种类：、种类：2、作用部位：、作用部位：两类两类Ecoli DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶 磷酸二酯键磷酸二酯键 基因工程中作为载体使用的基因工程中作为载体使用的DNADNA分子很多都是质分子很多都是质粒，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件粒，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。（1 1） 载体载体DNADNA必需有一个或多个限制酶的切必需有一个或多个限制酶的切割位点割位点，以便目的基因可以插入到载体上，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点去。这些供目的基因插入的限制酶的

5、切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。的插入而失活。（2 2） 载体载体DNADNA必需具备自我复制的能力必需具备自我复制的能力，或，或整合到受体染色体整合到受体染色体DNADNA上随染色体上随染色体DNADNA的复的复制而同步复制。制而同步复制。（3 3） 载体载体DNADNA必需带有标记基因必需带有标记基因，以便重组，以便重组后进行重组子的筛选。后进行重组子的筛选。知识点一：知识点一：1.1.原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编

6、码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶结合并能聚合酶结合并能起动起动mRNAmRNA合成合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，它能片断，它能阻碍阻碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离下来，模板链上脱离下来，使转录终止使转录终止。RNARNA聚合酶聚合酶: :能够能够识别启动子上

7、的结合位点并与其结合识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质的一种蛋白质.(.(以模板转录然后脱落以模板转录然后脱落) )不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区

8、上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 知识点一：知识点一：2.2.真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白

9、质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点等。聚合酶结合位点等。非编码序列：非编码序列： 包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核

10、细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定知识点二知识点二. .基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤有了目的基因，我们才有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用遗传、表达和发挥作用 载

11、体进入受体细胞稳定载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物物的基因在另一种生物中的转化。中的转化。 才能确定目的基因是否才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。遗传和正确表达。一、目的基因的获取一、目的基因的获取( (一一) )、目的基因主要是、目的基因主要是_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些（二）、获取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、利用化学

12、方法人工合成、利用化学方法人工合成请阅读请阅读P9P9第一和二两段第一和二两段一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取（一）从基因文库中直接获取1.1.基因文库：基因文库：概念见概念见P9P92.2.基因文库的分类基因文库的分类: :按外源按外源DNADNA片段的来源分类片段的来源分类种种类类基因组基因组DNADNA文库：文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因， 如：如：cDNAcDNA文库文库3.3.基因文库的目的基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便为了在不知目的基

13、因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。于获得所需的目的基因。4.4.获取目的基因的根据：获取目的基因的根据： 见课本见课本P9提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库5.5.基因文库的构建方法之一基因文库的构建方法之一（1 1）直接分离法）直接分离法( (鸟枪法鸟枪法) )某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与

14、载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶反转录法：反转录法：cDNAcDNA的合成流程图解的合成流程图解5.5.基因文库的构建方法之基因文库的构建方法之 概念概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段原理：原理：DNADNA复制复制2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸( (dNTPdNTP) ) 一对一对引物：引物：热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶( (TaqTaq酶）

15、酶）模板模板DNA( DNA( 需含有目的基因需含有目的基因 ) ) MgMg2+2+( (激活剂激活剂) )缓冲溶液缓冲溶液一对寡核苷酸序列：与目的基因一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补的起始段互补一段已知目的基因的核苷酸序列，以便一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物根据这一序列合成引物 过程过程高温变性（高温变性（90-9590-95 解旋解旋）低温退火（低温退火（55-6055-60 引物与单链结合引物与单链结合）适温延伸（适温延伸（70-7570-75 在在TaqTaq酶的作酶的作 用下合成与模板互补用下合成与模板互补 的的DNADNA双链双链）重复循环重复循环

16、PCR(多聚酶链式反应) 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ _ 、 _ ._ .等等原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（

17、前提条件）要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）3 3、人工合成的目的基因、人工合成的目的基因基因较小，核苷酸序列已知，可以利用基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNADNA合合成仪人工合成成仪人工合成二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核心1 1、目的、目的：使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并且可以并且可以遗传遗传给下一代，同时使目的给下一代，同时使目的基因能够基因能够表达表达和和发挥作用发挥作用。2 2、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+

18、 +标记基因标记基因它们各自的作它们各自的作用是什么用是什么?启动子：启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部聚合酶识别和结合的部位，有了它才能位，有了它才能驱动基因转驱动基因转录出录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是为了鉴别的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基受体细胞中是否含有目的基因因，从而将有目的基因的，从而将有目的基因的细细胞胞筛

19、选出来筛选出来载体载体与与基因表达载体基因表达载体的区别：二者都有标记的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分基因和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在片段。表达载体在载体基础上增加了载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部分结构三部分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的

20、基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1 1）农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力数单子叶植物没有感染能力原理：原理：TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的色体的DNADNA上。上。过程过程：优点：经济、有效。目前约优点：经济、有效。目前约80%80%的转基的转基因植物采用此方

21、法获得。因植物采用此方法获得。（2 2）基因枪法基因枪法（3 3）花粉管通道法花粉管通道法2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少质少方法：方法： 用用CaCa2+2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收感受态细胞吸

22、收DNADNA分子分子三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化： （二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定 目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞后后，是否可以稳定维持

23、和表达其遗传是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能特性，只有通过检测和鉴定才能知道。知道。（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 ( (关键步骤关键步骤) ).首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素片段用放射性同位素等作标记等作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显若显示出示出杂交带杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中（1）方法方法

24、: :DNADNA分子杂交分子杂交（2）过程）过程:归纳步骤（二）、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法: :分分 子子 杂杂 交交方法方法: :抗原抗原-抗体杂交抗体杂交过程过程: : 用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNAmRNA杂交杂交, ,若若出现杂交带出现杂交带, ,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNAmRNA练习练习1 1：(200

25、8(2008理综山东卷理综山东卷) )为扩大可耕地面积，为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。了耐盐水稻新品系。（1 1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNADNA分子所用分子所用的限制性内切酶作用于图中的的限制性内切酶作用于图中的 处，处，DNADNA连接酶作用于连接酶作用于 处。（填处。（填“a”a”或或“b”b”）aa练习练习1 1：(2008(2008理综山东卷理综山东卷) )为扩大可耕地面积，增为扩大可耕地面

26、积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。水稻新品系。（2 2）将重组）将重组DNADNA分子导入水稻受体细胞的常用方分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法有农杆菌转化法和 法。（法。（3 3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用需要利用 技术，该技技术，该技术的核心是术的核心是 和和 。（4 4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的要用

27、放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。基因枪法（花粉管通道法）基因枪法（花粉管通道法）植物组织培养植物组织培养脱分化和再分化脱分化和再分化耐盐基因耐盐基因一定浓度盐水浇灌一定浓度盐水浇灌1 1 ） 有 关 基 因 工 程 的 叙 述 正 确 的 是） 有 关 基 因 工 程 的 叙 述 正 确 的 是 （ ） A A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料资料2 2）基因工程是在）基因工程是在DNADNA分子水平上进行设计施分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，一定不进工的。在基因操作的基本步骤中，一定不进行碱基互补配对的步骤是行碱基互补配对的步骤是 （ ） A A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导