实验一 胡萝卜愈伤组织的诱导培养

1、本科学生综合性实验报告学号 114120238 姓名 杨万坤 学院 生命科学学院 专业、班级 11应用生物教育A班 实验课程名称 植物组培实验 教师及职称 龙维彪 开课学期 2013 至 2014 学年 第二 学期 填报时间 2014 年 5 月 20 日云南师范大学教务处编印一实验设计方案实验序号实验一实验名称胡萝卜愈伤组织的诱导培养实验时间实验室1 实验目的1-1、通过本次实验，使学生能熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂，巩固相关理论基础知识。1-2、通过本次实验，使学生进一步熟悉配制培养基的流程及操作中应注意的事项，学会设计和筛选胡萝卜愈伤组织诱导培养基配方。1-3、通过本

2、次实验，使同学能够熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术。1-4、通过本次实验，使学生进一步熟悉配制培养基的步骤，能熟练准确配制培养基；掌握愈伤组织状态的调控手段，设计适合的使愈伤组织增殖快、结构疏松的增殖培养基，以便能培养出下次细胞培养的材料。1-5、通过本次实验，使同学熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。2 实验原理、实验流程或装置示意图1-1、实验原理 培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养基质。配制培养基时，为了减少试剂称取时的工作量和少量称取时出现的误差，以及避免多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，预先要将各种营养成分配制

3、为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到要求的浓度。母液的浓度为培养基浓度的10倍、20倍、50倍、100倍等或更高1-2、实验原理 将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。1-3、实验原理将胡萝卜的贮藏根（根的变态）表面消毒后切割成小块在无菌条件下接种于愈伤组织诱导培养基上，诱导外植体脱分化产生愈伤组织。1-4、实验原理将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基1-5、实验原理将由胡萝卜肉质直根诱导产生的愈伤组织剥离转接到愈

4、伤组织增殖培养基上培养，即可实现愈伤组织的增殖试验流程（1）实验总体流程MS母液培养基的配置 胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配置 胡萝卜愈伤组织诱导 胡萝卜愈伤组织增殖培养基的配制 胡萝卜愈伤组织的继代培养（2）无菌操作流程：（3）胡萝卜愈伤组织诱导培养流程：(4)胡萝卜愈伤组织的继代培养流程：3 实验设备及材料3-1实验设备1-1、配制MS母液培养基所需的仪器设备和药品仪器：冰箱、普通天平、分析天平、各种型号的试剂瓶（棕色和白色）、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、搪瓷杯、药勺、称量纸、玻棒、标签纸、pH试纸（pH5.47.0），电磁炉、电热恒温干燥箱等药品：NH4NO3、KNO3、CaCl2&#

5、183;2H2O、 MgSO4·7H2O、KH2PO4、KI、H3BO3、MnSO4·4H2O、 ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、 CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、 Na2-EDTA·2H2O、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素 (维生素B1)、甘氨酸、蒸馏水。1-2、配置胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基所需的仪器设备和药品仪器：冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸（pH5.47.0）、药勺、称量纸、封口膜、橡皮筋/棉

6、线、电炉/电磁炉、高压蒸汽灭菌锅。药品试剂：MS培养基母液（大量元素、微量元素、铁盐、有机物）、琼脂、蔗糖、生长调节物质（ 2,4-D、6-BA、KT） 、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH。1-3胡萝卜愈伤组织诱导所需设备仪器：酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯等。超净工作台、恒温培养箱药品试剂：胡萝卜愈伤组织诱导培养基、无菌水、75酒精、0.1%HgCl2。1-4、胡萝卜愈伤组织增殖培养基的配制仪器：冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸（pH5.47.0）、药勺、称量纸、封口

7、膜、橡皮筋/棉线、电炉/电磁炉、高压蒸汽灭菌锅等。药品试剂：MS培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH1-5、胡萝卜愈伤组织的继代培养仪器：酒精棉球、小块纱布、已灭菌培养皿和滤纸、枪状镊子、解剖刀、酒精灯、超净工作台等。药品试剂：愈伤组织继代培养基、75酒精3-2实验材料胡萝卜肉质直根 处于脱分化进程中的外植体4 实验方法步骤及注意事项1、MS母液培养基的配置大量元素母液的配制母液种类 成 分 规定用量/mgL-1 浓缩倍数称取量/mg 母液定容体积/ml 配1L MS培养基吸取取量/ml 大量元素 KNO319002

8、0 380001000 50 NH4NO3165033000CaCl2 2H204408800MgSO4 7H2O3707400KH2PO4 170 3400 配制的步骤为：确定母液的浓度和体积计算各种化合物用量称量分别溶解混合定容装瓶贴标签放入冰箱保存（CaCl2 2H2O最后加入）。微量元素母液的配制母液种类 成 分 规定用量/mg L-1 浓缩倍数称取量/mg 母液定容体积/ml 配1L 培养基吸取量/ml 微量元素 MnSO4 H2O16.9200338010005ZnSO4 7H2O8.61720H3BO36.21240KI0.83166Na2MoO4 2H2O0.2550CuSO4

9、 5H2O0.0255CoCl2 6H2O 0.0255 配制的步骤为：确定母液的浓度和体积计算各种化合物用量称量分别溶解混合定容装瓶贴标签放入冰箱保存有机成分母液的配制母液种类成 分规定用量/mg L-1浓缩倍数称取量/mg母液定容体积/ml配1L MS培养基吸取量/ml有机成分甘氨酸2.02001002505盐酸硫胺素0.15盐酸吡哆素0.525烟酸0.525肌醇1005000配制的步骤为：确定母液的浓度和体积计算各种化合物用量称量溶解定容装瓶贴标签放入冰箱保存铁盐母液的配制母液种类成 分 规定用量/mg L-1 浓缩倍数称取量/mg 母液定容体积/ml 配1L MS培养基吸取量/ml 铁

10、盐 Na2EDTA 2H2O37.320037305005FeSO4 7H2O27.82780铁盐母液宜单独配制，其配制步骤为：确定母液的浓度和体积计算各种化合物用量称量分别溶解混合煮沸数分钟调节pH值至5.8 定容装瓶（棕色）贴标签放入冰箱保存。植物生长调节物质母液的配制母液种类成 分称取量(mg )母液定容体积(ml )母液浓度(mg/ml)生长素2,4-D501000.5NAA501000.5细胞分裂素6-BA101000.1KT101000.12,4-D/NAA用少量95酒精溶解，再加水定容；6-BA/KT应先溶于少量1 mol·L-1的HCl中，再加水定容。 盐酸（lmol

11、·L-1 ）：用浓度36.5%、密度1.19g/cm3的浓盐酸配制氢氧化钠（lmol·L-1 ）：用固体氢氧化钠配制75%酒精(v/v) ：用95%的酒精来配制稀铬酸洗涤液：重铬酸钾50 g溶于1000 ml蒸馏水中，冷却后缓慢加入工业用硫酸90 ml。2、胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配方及配制体积配方： MS基本培养基 1mg/L 2,4-D0.4mg/L 6-BA 0.2mg/LKT 0.7琼脂3蔗糖配方2： MS基本培养基 + 1mg/L NAA + 0.5mg/L 6-BA 0.7琼脂3蔗糖配制体积：每小组配制0.5L，用50ml三角瓶分装成20瓶，每人5瓶。实验步骤

12、（1）药品及用具的准备（2）培养基配制（3）调节培养基的酸碱性至pH5.8（4）培养基的分装（5）培养基的灭菌3、胡萝卜愈伤组织的诱导（1）准备工作 外植体表面灭菌前的准备工作a 接种室的清洁和消毒；b 超净工作台的开机和消毒；c 消毒溶液、无菌水、装材料的容器、解剖刀、镊子、培养皿、计时器、待用培养基等的准备。 实验材料的准备a 准备新鲜健康的胡萝卜肉质直根作实验材料；b 实验材料的修整、刷洗、冲洗； c 用洗衣粉水或肥皂水浸洗后再用自来水冲净。 （2） 植物材料的表面灭菌和接种操作人员洗手消毒装材料的容器及玻璃棒用酒精表面消毒将待消毒的材料浸入75的酒精中10秒，取出用无菌水冲洗干净。倒入

13、消毒剂（ 0.1%HgCl2 ）并计时到预定时间（20分钟）后倒出消毒液并用无菌水清洗干净。将材料切块后接种到诱导培养基上。4、胡萝卜愈伤组织增殖培养基的配制配方1： MS基本培养基 1mg/L 2，4-D0.5mg/L 6-BA200mg/L水解酪蛋白 0.7琼脂3蔗糖配方2： MS基本培养基 1mg/L NAA0.5mg/L 6-BA 0.7琼脂3蔗糖 配制体积：每小组配制0.5L，用50ml三角瓶分装成20瓶，每人5瓶。配方 1：大量元素:25 ml; 微量元素：2.5 ml; 有机物成分：2.5 ml; 铁盐：2.5 ml; 2,4-D ：1 ml； 6-BA：2.5ml；蔗糖:15g

14、； 琼脂：3.5g。配方2：大量元素:25 ml; 微量元素：2.5 ml; 有机物成分：各2.5 ml; 铁盐：各2.5 ml，NAA ：1 ml ；6-BA：2.5 ml；蔗糖:15g; 琼脂：3.5g。配置步骤：（1）药品及用具的准备（2）培养基配制（3）调节培养基的酸碱性至pH5.8（4）培养基的分装（5）培养基的灭菌5 胡萝卜愈伤组织的继代培养（1）准备工作接种室的清洁和消毒超净工作台的开机和消毒解剖刀、镊子、已灭菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备实验材料的准备（选择装有无污染的已分化出愈伤组织的外植体的三角瓶摆放于净工作台上）（2）愈伤组织继代培养将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的

15、无污染的外植体上产生的生长状态良好、色泽新鲜未褐化的愈伤组织剥离转接到愈伤组织继代培养基上，放置在25 全黑暗条件下进行愈伤组织的增值培养，以获得足够的愈伤组织，作为后续实验的实验材料。注意事项MS母液培养基的配置（1）玻璃器皿的洗涤（2）天平的使用（3）配制大量元素母液时溶液的混合顺序（4）铁盐的配制（5）洗液的配制（6）生长调节物质的配制胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配方及配制体积母液使用前的检查计量、称量、量取准确量取各母液的移液管单独使用，不混用加热溶解过程中液体不能外溢pH值的调节问题：理论上应调至5.8为宜，但因培养基经高温高压灭菌时，蔗糖分解，PH值会有所下降，因此调至6.0可减小误

16、差分装问题封口灭菌问题：高压蒸汽灭菌锅的使用、灭菌时间、灭菌温度接种培养基1、实验中要经常用酒精消毒、用酒精灯烧镊子、刀具，注意安全。2、材料经HgCl2消毒后，即认为是消毒干净，此后的操作中的用具要求无菌。为防止染菌，注意：手要用酒精擦干净；镊子和刀经常在火焰上烧；锥形瓶、手不要放在盛材料的培养皿上方。3、实验材料大小应适中，不宜太大或太小。4、实验中接种过程要在操净工作台进行，接种前，实验所用的所有器械及手均需严格消毒灭菌。6、接种时，动作要轻，力度适中。不要把接种的切块压入培养基里面，以致破坏培养基。接种时瓶口应倾斜45度，以免手、镊子上的赃物容易掉到三角瓶里5 实验数据处理方法采用记录

17、原数据以及课本资料提供数据进行配制及使用。6 参考文献植物组织培养教程（第3版） 李俊明 朱登云 中国农业大学出版社 2005.9二、实验报告1 实验现象与结果实验现象诱导胡萝卜愈伤组织胡萝卜愈伤组织诱导培养时，在恒温箱全黑条件下培养3周就可看出原胡萝卜块茎周围有许多疏松、淡黄色细胞组织团块，如图下：胡萝卜愈伤组织诱导培养结果由图可知4、5号培养基中愈伤组织长势良好，1、2、3号培养基培养失败，1、3号受细菌污染总接种瓶数 5总接种块数 20污染瓶数 3污染块数 10未污染瓶数 2未污染块数 10未污染块中愈伤组织发生块数8愈伤组织发

18、生率 40愈伤组织发生情况记录4,5号中有愈伤组织产生 ，但颜色较深，数量较少，结构比较紧密。污染情况及原因分析无菌操作中，没有保持培养瓶封口膜的无菌条件，最终造成污染; 镊子、解剖刀等在酒精灯上烧过立即放到盛酒精的烧杯里，将还未完全消除的细菌带入酒精，引起感染，从而影响实验结果; 操作时，手、三角瓶在盛材料的培养皿上方活动，容易把菌带到材料上继代培养由图可知-5（1）中的愈伤组织增值较多，结构疏松，黄色较深，-5（2）中的愈伤组织增值较少，结构较紧密，黄色较浅，有部分愈伤组织出现周边干燥死亡的现象。进行胡萝卜愈伤组织诱导，培养成功两瓶，其余3瓶均被细菌污染。其原因可能是在

19、无菌操作过程中，没有保持培养瓶封口膜的无菌条件或者是镊子、解剖刀等在酒精灯上烧过立即放到盛酒精的烧杯里，将还未完全消除的细菌带入酒精，最终造成污染；在整个实验过程中，一定要注意无菌操作，否则，任何一个环节染菌都会导致外植体被污染，实验失败对愈伤组织进行扩大的继代培养（-5（1）编号）的愈伤组织长势良好，未有污染 对愈伤组织进行分化培养（-5（2）编号）愈伤组织长势良好未有污染，未有污染，但其中有部分死亡，其原因为：愈伤组织继代培养中，愈伤组织生长需要大量的营养，由于培养时间过长，培养基中的营养成分及水分不能满足愈伤组织的继续生长和生活，故出现死亡。，2、对实验现象、实验结果的分析及其结论进行胡萝卜愈伤组织诱导，培养成功两瓶，其余3瓶均被细菌污染。其原因可能是在无