钙调蛋白的分离提纯.

1、 讲解人 ： 郭智妍 已知某蛋白某蛋白的分子量约为17 kDa，等电点等电点3.94.1，它能耐耐一定的高温高温，在90 C加热34 min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白含有较多的疏水疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂。请设计一个从脑组织中提取和分离纯化该蛋白的实验方案，要求写出具体的步骤和理由以及检测方法。1、钙调蛋白、钙调蛋白2、酸性蛋白质、酸性蛋白质3、加热变性沉淀法、加热变性沉淀法4、SDS阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂0201材料的选择材料的选择 和预处理和预处理0304精细纯化精细纯化05检测鉴定检测鉴定细胞破碎细胞破碎目标

2、物的提取目标物的提取与分离（粗提与分离（粗提取）取）01材料的选择和预处理材料的选择和预处理 一、 材料的选择和预处理材料的选择预处理大鼠脑组织将切取的组织用4预冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血渍，再用滤纸吸干残留的PBS（磷酸盐缓冲液） 一、 材料的选择和预处理缓冲液PH：一般来说，提取蛋白质时应在远离其pI的pH条件下进行，以不危及蛋白质的化学属性。蛋白酶抑制剂：动物组织含有多种蛋白酶，它们会使所需的蛋白质发生降解，在有些情况下还会改变它的活性。用蛋白酶抑制剂是很重要的。金属离子抑制剂：组织中有不同的金属离子，需利用螯合物（EDTA）与提取物中的蛋白质及其他化合物的相互作用来去除这些

3、金属阳离子。02 细胞破碎细胞破碎 二、 细胞破碎机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有： 玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎） 高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破裂。 物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 反复冻融法 冷热变替法 超声波法 化学及生物化学方法 二、 细胞破碎匀浆法 匀浆法（属于机械破碎）是指将适当溶媒加入到新鲜的生物组织中，在匀浆搅拌刀的强力作用下，细胞液中的活性成分迅速溶出到溶媒中的过程。具有成分提取率高，能耗低，提取不加温，提取速度快等优点。03目标物的提取与分离

4、目标物的提取与分离 三、 目标物的提取匀浆液在4下14 500 r/min离心30 min,收集上清液。沉淀物再用上述方法重新提取一次,合并上清液。差速离心法 三、 目标物的分离盐析沉淀法 利用钙调蛋白在中性或略碱性pH及不存在钙离子的条件下，钙调蛋白高度可溶的特性。等电点沉淀法 在等电点时，蛋白质在水溶液中的溶解度最低，会沉淀出来。加热变性沉淀法 钙调蛋白能够耐一定的高温，而其他蛋白在高温下会因加热变性而凝固 三、 目标物的分离 盐析沉淀法首先，用pH8.0条件下的硫酸铵溶液，把大部分蛋白质沉淀出来，而同时把钙调蛋白留在上清液中。在中性或略碱性pH及不存在钙离子的条件下，钙调蛋白是高度可溶的

5、。甚至在高盐浓度（60%饱和硫酸铵）下，pH8.0时，该蛋白也能留在溶液中。 等电点沉淀法 用50%硫酸将溶液的pH调至pH4.04.1之间。这可降低pH而不改变溶液中的主要阴离子即硫酸根离子。需要加的酸体积很小，故可很快降低pH，避免其他蛋白质在中间pH下沉出。 加热变性沉淀法 加热变性沉淀法：将蛋白质溶于少量缓冲液（20mM Tris-HCl，pH=7.0, 1mM咪唑，1 mMMgAC2,10uM CaCl2)中，加入少量蛋白酶抑制剂配成溶液，调pH=8.0，置于90水浴中煮沸34分钟，冰水浴冷却后离心，获取上清液。04 精细纯化精细纯化 四、 精细纯化透析：方法：将上清液在纤维素透析袋

6、中透析。原理是：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。目的：去除蛋白液中的配体离子。离子交换层析：前提：钙调蛋白是一种强酸性蛋白因而在中性或微碱性pH条件下带有大量净负电荷。原理：在低离子强度条件下，钙调蛋白会与带正电荷的树脂结合，而许多等电点较高的蛋白质则不结合。然后，改变条件将结合的蛋白质分别洗脱下来。亲和色谱的洗脱05检测鉴定检测鉴定 五、 检测鉴定定性分析（1）分子量 : 电泳、质谱 (可同时鉴定分子量和纯度)（2）活性 : 根据蛋白质的功能选用不同的活性检测方法定量分析（1）紫外检测法：简单快速、不破坏样品、准确度低（2）考马斯亮蓝染色法（

7、Bradford法）：简单迅速、干扰少、灵敏度高(1g)（3）Folin-酚试剂法（Lowry法）： 灵敏度高、是常用的方法 五、 检测鉴定SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，将提纯出来的钙调蛋白在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。十二烷基硫酸钠 五、 检测鉴定（1）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量（2）质谱法 五、 检测鉴定23实验流程图实验流程图1王新生,李海峰,赵荧,赵铁军,张晓丽,薄爱华. 黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化早期胞内钙调蛋白mRNA的转录水平J. 中国组织工程研究与临床康复,2009,23:4495-4499.2梁秋芬,刘宽灿,徐碧玉,金志强. 钙调蛋白在植物发育中的功能J. 生命科学研究,2005,S2:1-5.3蒋淑君,王桂兰,崔存德,徐红. 淫羊藿总黄酮对肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴钙调蛋白基因表达的影响J. 中国应用生理学杂志,20