项目一核酸的生产

1、核酸与蛋白质一样，是生物体内重要的生物大分子，具有复杂的结构和极其重要的生物学功能，是生物遗传繁殖物质的基础。天然存在的核酸有两大类，一类是脱氧核糖核酸（DNA），另一类是核糖核酸（RNA）。他们都是由不同的单核苷酸为基本单位构成的多聚核苷酸链。DNA是遗传信息的载体，与生物的繁殖、遗传及变异有密切关系；RNA的功能主要是参与体内蛋白质生物合成过程，根据其结构不同，可分为信使RNA（mRNA)、核蛋白体RNA（rRNA）和转运RNA（tRNA）三种。大多数生物细胞都含有上述两类核酸，DNA:主要存在于细胞核内，线粒体内也含有少量；RNA：主要分布在细胞质、细胞核和线粒体内；对于病毒来说，只有含

2、有RNA或DNA中的一种，据此可将病毒分为RNA病毒和DNA病毒。核酸的结构：主要元素：碳（C）、氢（H）、氧（O）、氮（N）、磷（P）等，其中磷的含量在各种核算中变化范围不大，大约占整个核酸质量的9%-10%。因此，在核酸定量分析时，可通过磷酸量的测定来估算生物样品中核酸的含量。核酸基本组成单位是核苷酸，采用不同的水解方法（酶解、酸解或碱解）可将核酸降解成核苷酸，核苷酸可再分解成核苷和磷酸，而核苷可进一步分解生成戊糖和碱基。核酸是两性电解质，含有酸性的磷酰基和碱性的碱基。核酸和蛋白质一样具有等电点，因此在一定PH下，用电泳法和离子交换法分离纯化核酸。核酸中嘌呤和嘧啶基具有共轭双键，具有紫外吸

3、收性质，其最大吸收峰在260nm附近。根据核酸紫外吸收值得变化，可判断其变性或水解程度。核酸有有变性和复性。1.核酸的提取和分离 提取核酸的一般原则是先破碎细胞，提取核蛋白使其与其他细胞分离，然后用蛋白质变性剂如苯酚或去垢剂等，亦可用蛋白酶处理除去蛋白质，将核酸和蛋白质分离，再用乙醇等将核酸沉淀。（1）核蛋白的提取 核酸在自然的状态下往往以核蛋白的形式存在。根据DNA蛋白和RNA蛋白在不同浓度的氯化钠溶液中溶解度不同的特点，可将它们从细胞匀浆中提取出来并将两者分离 （2）核蛋白中蛋白质的去除 提取到核蛋白后，还要去除其分子中的蛋白质成分，才能得到核酸。 （3）核酸的纯化 核蛋白中的蛋白质被除去

4、后，得到的核酸需要进一步分离纯化2.核酸含量的测定 核酸含量的测定常用的方法有紫外吸收法、定磷法，定糖法等。 紫外吸收法：利用核酸组分嘌呤环、嘧啶环具有紫外吸收的特性测定核酸含量。DNA的提取分为两类： 第一类：具有天然结构的核酸类物质，多数能自己合成，包括肌苷，ATP，辅酶A，脱氧核苷酸，肌苷酸，GTP，腺嘌呤，用于血小板减少症，白细胞减少症，急慢性肝炎，心血管疾病，肌肉萎缩等疾病。第二类：自然结构碱基，核苷，核苷酸类似物或聚合物，用于治疗病毒，肿瘤，艾滋病的药物，也是产生干扰素，免疫抑制剂的临床药物。DNA的结构模型：1.DNA生产的原理 DNA在Nacl溶液中的溶解度随Nacl浓度的不不

5、同而不同。 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的其他 许多物质溶于酒精溶液。 DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色；DNA还有遇甲基绿溶液被染成蓝绿色的特性。 提取时的材料用具： 试剂：体积分数为95%的酒精溶液（a冷却的）质量浓度为0.1g/mL的b柠檬酸钠溶液 物质的量浓度分别为2mol/L和0.015 mol /L的氯化钠溶液 二苯胺试剂 c蒸馏水 鸡血细胞液。 用具：铁架台 ，铁环，镊子，三脚架，酒 精灯，石棉网，载玻片，玻璃棒，滤纸，滴管，量筒，烧杯，试管，漏斗，试管夹，纱布。提取鸡血中DNA的流程： 1、将50ml鸡血中加入蒸馏水20ml（涨破 红细胞） 2、加2mol/L的NaCl溶

6、液40ml（溶解DNA） 3、再加蒸馏水（析出DNA） 4、过滤(得DNA粘稠物 ) 5、再加2mol/L的氯化钠溶液20ml(再溶解) 6、再过滤(留滤液去杂质) 7、加冷酒精（搅拌析出）DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成w羟基r酮基戊醛，它再和二苯胺作用而显现蓝色（溶液呈浅蓝色）。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关来源：制备RNA的丰富资源是微生物，含量为5%25%，在酵母中占2.7%15%，工业上主要培养酵母菌体，提取RNA，收率较高原理：细胞内大部份RNA均与蛋白质结合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。因此，分离制备RNA时，首先遇到的是必须使RNA与蛋白解离，并除

7、去蛋白质实验试剂 ：0.05mol/L醋酸缓冲液（PH5.0） 25%SDS 80 酚 2mol/L醋酸钠 95乙醇样品待测液：准确稀释成每毫升溶液含RNA干燥 制品50-100g地衣酚试剂1、将新鲜兔肝浸入预冷0度0.05mol/L醋酸钠缓冲液(PH5.0)中,除去肝脏处的结缔组织,除去血凝,用滤纸吸干,称取0.9克。 2、取0.9克肝脏,加入 0.05mol/L醋酸缓冲液(PH5.0)9毫升,250克/升.SDS1.5毫升,移入匀浆管中,匀浆后再加入等体积80%酚,再匀浆一次。 3、移入三角瓶中,置65度水浴中继续振摇5-8分,取出流水冷却。除了可用紫外吸收法及定磷法外，常用地衣酚法测定，其反应原理是当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3， 5-二羟甲苯（地衣酚orcinol)反应，在Fe3+或Cu+催化下，生成鲜绿色的复合物反应产物在670nm处有最大吸收。1.DNA的检测DNA是磷酸和戊糖通过二酯键形成的长链，所以磷酸或戊糖的量正比于DNA的量，可通过测定磷酸或戊糖的量来测定DNA的量，前者称为定磷法，后者称为定糖法2.RNA的检测RNA含量测定