荞麦中的多酚提取和鉴定

1、本科毕业论文（设计） 甜荞麸皮中咖啡酰吡喃鼠李糖基吡喃葡萄糖苷的分离纯化及抗氧化活性分析 姓 名 顾焱 班 级 应用化学1101 学 号 4103110124 指导老师 刘琴 答辩日期 2015.06.06 目录1前言61.1荞麦简介61.2植物多酚61.3植物多酚的生物活性71.3.1清除自由基、抗氧化71.3.2抗病毒、抗菌功能71.3.3抗肿瘤活性71.3.4抗心脑血管疾病81.3.5美白防晒、延缓衰老81.4甜荞多酚81.5多酚的提取方法81.6多酚的分离纯化方法91.6.1大孔树脂柱层析91.6.2聚酰胺柱层析91.6.3葡聚糖凝胶柱层析101.6.4 HPLC/MS检测方法简介10

2、1.7多酚抗氧化活性的测定方法111.7.1 DPPH法(Radical Scavenging Capacity Assay)111.7.2 FRAP法(Ferric-reducing Antioxidant Power)111.8本文研究目的122实验材料与方法132.1 材料和试剂132.2 仪器设备132.3 实验方法142.3.1样品的预处理142.3.2荞麦麸皮中多酚的提取142.3.3液质联用法(HPLC-MS)鉴定甜荞麸皮中的多酚142.3.4甜荞麸皮多酚的分离纯化152.3.4.1大孔树脂分离152.3.4.2聚酰胺分离162.3.4.3 Sephadex-LH 20葡聚糖分离

3、162.3.5分离纯化产物的抗氧化性分析172.3.5.1 DPPH法172.3.5.2 FRAP法182.3.6数据分析203实验结果与讨论203.1荞麦麸皮粗提液的液相色谱析203.2大孔树脂分离纯化223.3聚酰胺分离纯化233.4 Sephadex-LH 20葡聚糖的分离纯化263.5 咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷的抗氧化性分析274结论与展望295参考文献296致谢32甜荞麸皮中咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷的分离纯化及抗氧化活性分析摘要：本文主要以甜荞麸为原料，对甜荞麸中的多酚进行提取，再分别利用不同的柱层析方法对其中的咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷进行分离纯化，最后对纯化

4、产物进行抗氧化性分析。经鉴定甜荞麸皮中主要有15种多酚成分，其中最主要的物质为咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷；先后分别利用大孔树脂、聚酰胺和Sephadex-LH20葡聚糖凝胶柱层析方法使咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷得到了纯化；最后用DPPH和FRAP方法对纯化产物及其苷元咖啡酸进行抗氧化性比较，发现纯化产物的抗氧化性远远低于咖啡酸，由此推断其中的糖苷键可能是由咖啡酰中酚羟基与糖环中的酚羟基形成。关键词：甜荞麸； 多酚； 分离纯化； 咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷；抗氧化性The purification and antioxidant activity studies of caff

5、eoyl-rhamnopyranoside-glucopyra-noside in common buckwheat branAbstract:In this work, polyphenol in common buckwheat bran was separated and purified by using column chromatography in order to get caffeoyl-rhamno-pyranoside-glucopyra-noside. The antioxidant activity of purified caffeoyl-rham- nopyran

6、oside-glucopyra-noside was studied as well. Fifteen polyphenol species were detected in the common buckwheat bran, and caffeoyl-rhamnopyranoside-glucopyra-noside had highest content. Therefore, caffeoyl-rhamnopyranoside-glu-copyra-noside was purified by colomn chromatography method and macroporousre

7、sin, polyamide combine with glucan (Sephadex-LH20) ere used as purification ma-terial. The antioxidant activities of purified product were then studied by DPPHand FRAP method. The results showed that the antioxidant activity of caffeoyl-rhamnopyranside-glucopyranoside was much lower than that of caf

8、feic acid inboth methods. As a result, a structure of the product was proposed.Keywords: common buckwheat bran; polyphenol; purification; cafeoyl-rhamn- opyranoside-glucopyranoside; antioxidant activity;1前言1.1荞麦简介荞麦是一种古老的荞麦属植物(蓼科)，其起源于中国和其他的亚洲国家，一年一熟，荞麦属约有19种。荞麦有两个大的分类甜荞和苦荞。荞麦是一种重要的粮食作物，为传统农民的农业生产和生

9、存提供了保障。荞麦作为一种绿色的保健类食品已经风靡全世界，主要在于因为荞麦中含有较高生物价的蛋白质和丰富的维生素。近几年的研究表明，荞麦中最重要的具有保健效果的物质是多酚类物质。苦荞中的主要多酚类物质为芦丁，它其有强化毛细血管、降血压、预防脑中风等功效1。而甜荞中的多酚类物质比苦荞中要丰富得多,在甜荞壳、麸皮和粉中的分布各不相同。1.2植物多酚一般，我们将多个羟基与一个或多个苯环相连的化合物统称为多酚类化合物。植物多酚(Plant polyphenol)又名植物单宁(Vegetable tannin)，具有多元酚结构，主要存在于植物的皮、根、叶子、和果实中2。Haslam将植物多酚分为棸棓酸酯

10、类和聚黄烷醇类两大基本类型，其统称为植物多酚。棸棓酸酯类多酚的分子内具有酯键，一般以多元醇为中心，由酯键与多个酚羧酸相连接而成。不稳定，其在酸、碱、酶的作用下容易水解。聚黄烷醇类多酚是一种是黄烷醇聚合物，其分子中的芳香环全部以C-C键相连，难水解，强酸条件下可缩合成不溶于水的物质3。由于具有独特的功能活性,目前植物多酚已广泛应用于医学、食品、制革和日用化工等相关领域,并发挥着不可替代的作用。同时,随着天然产物开发利用的逐渐兴起,植物多酚类物质已成为天然产物和有化学研究的热点,国内外研工作者纷纷从各个领域和角度对植物多酚开展了广泛深入的研究工作4,5。1.3植物多酚的生物活性1.3.1清除自由基

11、、抗氧化多酚类物质因其羟基取代的高反应性和吞噬自由基的能力而具有很好的抗氧化活性。多酚以大量的酚羟基作为氢供体，可以将活性较高的单线态氧1O2，变为活性较低的三线态氧3O2，对多种活氧具有清除作用，从而减少自由基产生的可能性，同时也是各种自由基的有效的清除剂，生成活性较低的多酚自由基，从而打断自由基氧化的锁链反应；其次，多酚可以邻位二羟基与金属离子螯合，减少金属离子对氧化反应的催化；再者，对于有氧化酶存在的体系，如体内主要的氧自由基生成的源头XOD，多对其有显著的抑制能力；植物多酚还能与 VC和 VE等抗氧化剂间产生协同效应，具有增效剂作用6。1.3.2抗病毒、抗菌功能以单宁为主体的植物多酚对

12、微生物具有广谱性，其机理为：以单宁为主的多酚可以和微生物的体内的酶结合(如纤维素酶、果胶酶)，从而抑制该类酶的活性以达到抑菌的效。对细菌的最低抑制浓度MIC范围一般0.0121 g/L之间，对酵母为25125 g/L7。1.3.3抗肿瘤活性植物多酚的抗癌作用已经得到证实，其机理主要是清除自由基、调控致癌过程中的关键酶、直接与亲电子的最终致癌物作用，抑制癌细胞的增值，从而抑制癌症的发生8。有统计资料显示，日本国内绿茶消费较多的地区，胃癌发病率较低。长期饮用绿茶、水果以及蔬菜，也能有效减少癌症和肿瘤的发病率。已有研究证明，绿茶、花茶、乌龙茶均有抗癌作用，这是由于茶叶中的茶多酚可以阻断亚硝酸盐等多种

13、致癌物质在体内合成，并具有直杀伤癌细胞的功效，对胃癌、肠癌等多种癌症的预防和治疗均有裨益。长期饮用，能减少癌症和肿瘤发病率9。1.3.4抗心脑血管疾病多酚能够有效诱导血管舒张，抑制血小板的聚粘连和抑制脂新陈代谢中的酶作用，故有助于防止动脉粥样硬化、中风和冠心病等常见心脑血管疾病的发生10。1.3.5美白防晒、延缓衰老植物多酚在200300nm之间尤其是在远紫外区具有很强的紫外吸收能力。多酚还能够有效抑制皮肤黑色素的生成，从而起到美白防晒的作用11。同时多酚也能够促进皮肤新陈代谢和延缓皮肤衰老。故多酚可作为许多具有美白、防晒和抗老化功效的化妆品的有效成分。 1.4甜荞多酚Mitsuru Wata

14、naba12经过对甜荞麦籽粒进行研究后表明,荞麦籽粒中抗氧化成分主要是(-)-表儿茶素、(-)-表儿茶素-3-O-P-羟基苯甲酸苷、(+)-儿茶素-7-O-b-D-吡喃葡萄糖苷、(-)-表儿茶素-3-O-(3，4-双甲氧基)棓酸盐(属黄烷醇),它们比芦丁含量多,且抗氧化性比芦丁强。33Mitsuru Watanba在甜荞壳中发现以下五种主要的抗氧化剂：原儿茶酸、3，4双羟基苯甲醛、槲皮黄酮、金丝桃苷和芦丁13。1.5多酚的提取方法常见的多酚的提取方法有溶剂提取法、微波辅助提取、超声波辅助提取、生物酶解提取、超临界流体萃取和膜技术提取法等。溶剂提取法是一种较为传统的提取方法，也是当下采用的最广泛

15、的提取方法。考虑溶剂的选择时，一般我们会遵循相似相溶的原则。由于多酚是一种极性较强的化合物，应该选择大极性的溶剂提取。一般实验中我们会在除杂之后的荞麦原料中加入极性较大的水、乙醇、丙酮、甲醇、乙酸乙酯等作为提取剂。除杂过程可用活性炭脱色、氯仿除杂、石油醚除色素、低温静置等方法14,15。有些有机溶剂回收难，有毒性，因此，溶剂法的缺点是：(1)涉及的有机溶剂多且用量大；(2)工序多工艺繁琐复杂，需多次蒸馏；(3)加热时间长，产品及操作不够安全，生产成本偏高16。1.6多酚的分离纯化方法1.6.1大孔树脂柱层析大孔树脂是一种内部具有三维空间立体孔结构,孔径与比表面积都比较大的高分子聚合物,它不溶于

16、酸、碱及乙醇、丙酮和烃类等有机溶剂,对氧、热和化学试剂稳定。大孔树脂包括大孔离子交换树脂和大孔吸附树脂,一般认为,依靠物理界面力作用引起溶液中溶质浓度的减少称为吸附,因化学作用引起溶液中溶质变化的称为离子交换17。采用大孔树脂对荞麦中存在的各种多酚的分离，先利用大孔树脂将荞麦中多酚进行吸附，然后依靠每种多酚的极性的差异，用不同浓度的甲醇溶液进行梯度洗脱，将冲出的液体流经紫外检测仪，紫外检测仪的示数的变化进行分接，以达到将不同的多酚进行粗分离的目的。1.6.2聚酰胺柱层析聚酰胺(Polymide)是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化合物层析柱分离中常用的聚酰胺是由己内酰胺聚合而成的尼龙6和由己二酸

17、和己二胺聚合而成的尼龙66。聚酰胺不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿以及丙酮等有机溶剂，对碱较稳定，对酸尤其是无机酸的稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。聚酰胺由酰胺键聚合形成的高分子聚合物。其酰胺基可以与羟基酚类、酸类、醌类等化合物以氢键形成结合而被吸附，其脂肪长链可作为分配层析的载体。聚酰胺在含水系统中层析时，聚酰胺作为非极性固定相，其层析行为为反向层析柱；在非水溶剂系统时，聚酰胺作为分配层析的载体，其层析行为为正向层析柱。聚酰胺分子中有极性酰胺基团和非极性的脂肪键。作为一个相对弱极性的化合物，当移动相为极性强的溶剂时，聚酰胺作为非性固定相，其层析行为类似反向分配层析，极性交大的吸附物易

18、被洗脱。随着洗脱剂极性降低，极性小的化合物可相继被洗脱下来。1.6.3葡聚糖凝胶柱层析凝胶层析是一种液相层析，机理是分子筛效应。当洗脱开始以后，小分子可以进入凝胶颗粒内部，流程长，流动慢；大分子不能进入凝胶颗粒内部，流程短，流动快。这样就可以是大小不同的分子分开18。Sephadex G和Sephadex LH-20是分离多酚类化合物时最常使用凝胶材料，它们洗脱速度快，可以反复使用而且分离物质损失较少。其中交联葡聚糖凝胶Sephadex LH-20为分离纯化植物中天然活性物质最广泛使用的葡聚糖凝胶。Sephadex LH-20为亲脂性的凝胶，其分离原理主要是凝胶过滤，当洗脱剂为反相溶剂(常见的

19、为醇和水的混合溶剂)时，还有伴随着反相分配作用，即极性大的物质先洗脱出，极性小的后洗脱出。多酚化合物在葡聚糖凝胶上的吸附能力的主要取决于分子中的游离羟基数，游离羟基越多吸附能力越强。Sephadex LH-20葡聚糖凝胶常用有机溶剂醇和水按不同比例混合的混合溶剂作为洗脱剂，可以用一种浓度的醇溶液等梯度洗脱，也可以逐步提高甲醇的含量，进行梯度洗脱。 1.6.4 HPLC/MS检测方法简介高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography /HPLC)具有易操作、灵敏度高和稳定性好等特点，已成为分析测定黄酮类物质的主要方法。应用HPLC进行分析时，一般根据

20、同种物质在相同的液相条件下保留时间相同，以及不同黄酮类物质具有不同的紫外特征吸收的特点，与标准品进行对照来确定黄酮类物质的种类。同时HPLC可以进行准确的定量分析，因此应用非常的广泛。但是要鉴定一种未知的黄酮类物质的结构，只用HPLC分析是远远不够的。液质联用(HPLC/MS法集色谱分离和质谱定性为一体简化了复杂体系的前处理，并可获得被测组分的结构信息，因此在黄酮化合物的分析中具有很大优势。1.7多酚抗氧化活性的测定方法1.7.1 DPPH法(Radical Scavenging Capacity Assay)DPPH 自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)是一种

21、稳定的人工合成自由基，其醇溶液在 516 nm 处有一特征的紫红色团吸收峰。在抗氧化剂存在的条件下，抗氧化剂提供一个 H 质子使 DPPH 形成稳定的 DPPH-H 分子，溶液的颜色从紫红色慢慢转变成淡黄色导致其在 516nm 处的吸光度减少。通常利用 DPPH 自由基的褪色反应研究天然产物的抗氧化活性，其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系，因而可用紫外分光度法进行定量分析酚酸类物质的抗氧化活性。该方法因具有操作简单、快速、可靠等优点，在抗氧化活性的研究中被广泛的应用19。1.7.2 FRAP法(Ferric-reducing Antioxidant Power)FRAP法即“亚铁还原能力实

22、验”，其测定总抗氧化能力的原理是：酸性条件下，抗氧化物可以还原Fe3+-TPTZ产生蓝紫色的Fe2+-TPTZ，随后在596nm测定吸光度，其吸光度的变化与还原物质的含量呈比例关系，即可作为样品的总抗氧化能力的指标。由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。并且由于样品的Fe3+或Fe2+的总浓度通常低于10M，因此样品中的Fe3+或Fe2+不会显著干扰FRAP法的检反应。由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应20。1.8本文研究目的甜荞作为药食两用的粗粮得到了人们越来越多亲睐，甜荞麸皮中含有丰富的具有抗氧化

23、性的植物化学素，如多酚等物质，这类物质可以作为功能性成分添加在食品中或用于生产功能保健品。甜荞麸皮中多酚的种类丰富，咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷是其中最主要物质，目前还没有对于物质进行分离纯化的报道。本课题的研究以甜荞麸皮为原料，对其多酚多酚类物质进行提取，并分别利用大孔树脂、聚酰胺和Sehpdex-LH20葡聚糖凝胶柱层析方法，对咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷进行分离纯化，对纯化产物与其苷元咖啡酸进行抗氧化性比较，研究糖苷对多酚类物质抗氧化活性的影响。本文通过对甜荞麸皮中咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷提取纯化工艺条件的探索和氧化活性的研究，对甜荞麸皮加工再利用需找新的途径，也为多酚类

24、物质抗氧化性研究提供基础研究的数据。2实验材料与方法2.1 材料和试剂甜荞，购自苏果超市；AB-8型大孔树脂，购自天津大学化工厂；聚酰胺树脂，购自上海源叶生物科技有限公司；Sephadex-LH 20葡聚糖凝胶，购自上海蓝技科技发展有限公司；石油醚、丙酮、甲醇、乙醇、盐酸均为分析纯，购自南京化学试剂有限公司；Trolox(水溶性VE)、1,1- 二苯基-2- 苦肼基(DPPH自由基)、2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪(TPTZ)、2，2偶氮二异丁基脒二盐酸盐(AAPH)、荧光素钠(Fluorescein disodium)，购自Sigma-Aldrich 公司；2.2 仪器设备德

25、国Retsch超离心粉碎仪ZM200；西德 Brabander-880200 型磨粉机；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；电子天平JA5003N，上海精密科学仪器有限公司；Allegra 64R高速冷冻离心机 ，美国贝克曼公司；SHZ-D(III)循环水式真空泵，巩义市子华仪器有限公司；HL-2恒流泵，上海沪西分析仪器厂；高效液相色谱及质谱联用仪(Agilent 1100 LC/ MSD VL)；752紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；水浴恒温振荡器SHA-B金坛市荣华仪器造有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；ZNHW-II型精密电子控制仪，杭州大卫科教

26、仪器有限公司；2.3 实验方法2.3.1样品的预处理将超市购买的甜荞用超离心粉碎仪进行粉碎、过40目和80目的筛。取过40目但不过80目的粉末作为甜荞麸皮原料。将粉末包入滤纸，于索氏提取器用石油醚除油8h，晾干至室温后作为原料备用。2.3.2荞麦麸皮中多酚的提取准确称量已除油的荞麦麸皮30g，以1:15料液比加入450ml 30%(体积比)丙酮水，在40条件下于恒温水浴锅中震荡提取2h。将所得提取液进行减压抽滤，取滤液进行旋转蒸发，将蒸发所得残渣用50%甲醇定容至10ml。用高速冷离心机于18000r/min，20条件下离心20min。取离心后的上层清液过0.45um微孔滤膜，得粗提液。将粗提

27、液做高效液相色谱分析。2.3.3液质联用法(HPLC-MS)鉴定甜荞麸皮中的多酚甜荞麸皮提取液的液质联用方法：自动进样，进样量：10L，液相色谱部分条件为：流动相A为1% HAc水，流动相B为含1% HAc的甲醇，流速为 0.5 mL /min，控制柱温 35，采用DAD检测器，检测波长为320nm、280nm。按照表1梯度洗脱：质谱条件：控制雾化气(N2 )气压为25(Psi)；干燥气(N2)流量为 9(l/min)；毛细管温度为350，毛细管电压为3.0 kV，采用负离子模式。质谱测定范围：m/z 100-2000。表1 HPLC洗脱梯度时间（min）A%B%020803035655550

28、506060406560407010907520802.3.4甜荞麸皮多酚的分离纯化2.3.4.1大孔树脂分离大孔树脂的预处理：将大孔树脂用95%的乙醇浸泡24h，以冲出其中的杂质。将除杂之后的大孔树脂用蒸馏水冲洗数次，置换出其中的乙醇。大孔树脂的装柱：(1) 将层析柱与地面垂直装上铁架台，盖上两端的塞子(注意下方塞子有一层膜，不要装反)，用止水夹夹住下方软管，向柱子中加入少量蒸馏水。(2) 将烧杯中的大孔树脂通过一根玻璃棒的引流作用倒入层析柱中，并且将烧杯中的剩余的大孔树脂用少量的蒸馏水冲洗一并倒入层析柱。(3) 打开止水夹，将层析柱中的部分水排出，以达到将层析柱中大孔树脂压实的目的，但与此

29、同时应该保持大孔树脂上方的水面有一定的高度以防产生气泡影响分离效果。(4) 待大孔树脂全部转移进入层析柱中，用一定量的蒸馏水冲洗(约300ml)，以达到充分置换的目的。大孔树脂分离：根据大孔树脂的静态吸附及解吸曲线，取适量的大孔树脂经预处理装柱，用蒸馏水冲洗三遍(约500ml)，待水层接近大孔树脂顶部1cm时开始缓慢滴加待分离溶液，然后用蒸馏水洗脱，约400ml，然后依次用，600ml 40%的甲醇，600ml 60%的甲醇，300ml 70%丙酮洗脱，根据连接的紫外检测仪，在280nm检测下吸光度值的变化收集脱液，并将收集的洗脱液旋转蒸发，用50%甲醇水溶液定容至5ml，并且过0.45um微

30、孔滤膜，然后做高效液相色谱及质谱分析，合并成分相近的组分。2.3.4.2聚酰胺分离聚酰胺的前处理： 取适量聚酰胺以90-95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后将聚酰胺装入色谱柱中，并对聚酰胺进行预处理：先用95%乙醇洗脱聚酰胺材料，洗至洗脱液透明并在蒸干后没有出现残渣；再依次用2倍柱体积的5%NaOH水溶液洗脱柱子，接着用1倍体积的蒸馏水洗去柱中的NaOH，然后用2倍体积的10% 醋酸水溶液中和柱子，最后用不少于4倍柱体积的蒸馏水将聚酰胺洗至pH中性。将预处理好的聚酰胺重新装柱。 聚酰胺分离：向装好的的聚酰胺柱中加入经过大孔树脂柱后合并浓缩的含有待分离物的组分，然后依次用500ml水，400ml

31、 10%的甲醇水，400ml 30%的甲醇水，450ml 50%的甲醇水，1000ml 80%的甲醇水，400ml 95%的甲醇水洗脱，根据连接的紫外检测仪，在280nm检测下吸光度值的变化收洗脱液，并将收集的洗脱液旋转蒸发，用50%甲醇水溶液定容至5ml，并且过0.45um微孔滤膜，然后做高效液相色谱及质谱分析，合并成分相近的组分。2.3.4.3 Sephadex-LH 20葡聚糖分离葡聚糖的前处理：取一定量的葡聚糖，用蒸馏水溶胀48h，去掉悬浮颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液体中的气体除掉。将层析柱洗干净竖直固定到铁架台上，加入少量的蒸馏水，装入适量

32、的葡聚糖凝胶(玻璃棒引流)。打开下端的止水夹，以压实柱内的葡聚糖，重复上述步骤，待加入的葡聚糖达到一定的厚度时，停止倒入葡聚糖，用300ml的蒸馏水冲洗一段时间。葡聚糖凝胶分离：取出处理完毕的葡聚糖凝胶(换一只干净烧杯)，对取出的凝胶进行重新装柱,由于葡聚糖凝胶容易分层，故此次装柱要一次完成。待重新装柱完成之后，打开下端止水夹，压实凝胶。待水面高过凝胶上层约1cm时，加入待分离组分。依次用200ml蒸馏水、300ml 10%、20%、30%、40%和50%甲醇水进行梯度洗脱。根据连接的紫外检测仪，在280nm检测下吸光度值的变化集洗脱液，并将收集的洗脱液旋转蒸发，用50%甲醇水溶液定容至5ml

33、，并且过0.45um微孔滤膜，然后做高效液相色谱及质谱分析，并成分相近的组分。2.3.5分离纯化产物的抗氧化性分析将分离出来的样品冻干，得到咖啡酰吡喃鼠李糖基-吡喃葡萄糖苷的粉末，待用。2.3.5.1 DPPH法(1)标准品的配制：准确称取0.013g水溶性维生素E，同无水甲醇溶解至25mL。得到2.0mmol/L的储备液。分别取上述储备液80，310，540，770，1000 L用无水甲醇定容至2mL，稀释得到浓度分别为0.08mmol/L，0.31mmol/L，0.54mmol/L，0.77mmol/L，1.0mmol/L的标准溶液。(2)DPPH的配制：准确称取DPPH 0.00985g

34、用无水甲醇定容至250mL，得到0.1 mmol/L的DPPH溶液(避光保存，即配即用)。(3)标准曲线的制定取上述不同浓度的标准溶液各0.3mL，加入0.1mmol/L的DPPH溶液6ml于10mL试管中，避光并封口于 25水浴反应60min，于516nm处测定其吸光度值(每组3个平行)。计算DPPH自由基的清除率 A%：A%= (A0 - At)/A0 *100 (At为样品和DPPH的吸光度值；A0为无水甲醇和DPPH的吸光度值)。以自由基清除率A%为纵坐标，以水溶性维生素E的浓度(mmol/L)为横坐标，得到的标准曲线为A=145.16B-2.0987，R2=0.9990。式中A为DP

35、PH清除率，B为水溶性维生素E的浓度。(4)样品抗氧化性的测定准确称取不同质量的样品，用甲醇溶解并定容至25mL，得到浓度均为1.0 mmol/L的溶液。取0.3mL样品溶液，加入 6.0mL 0.1mmol/L 的 DPPH 溶液于10mL试管，避光并封口于 25水浴反应60min，于516nm处测其吸光度(每种样品3个平行)。用水溶性维生素E(Trolx)做标准品，根据标准曲线计算结果用Trolox 当量表示(mmol/g)，即每克样品干重对 DPPH 自由基清除能力相当于Trolox 的毫摩尔数。2.3.5.2 FRAP法(1)标准品的配制:准确称取0.013g水溶性维生素E，同无水甲醇

36、溶解至25mL。得到2.0 mmol/L的储备液。分别取上述储备液80，310，540，770，1000 ，1200，1500，1800,2000L用无水甲醇定容至2mL，稀释得到浓度分别为0.08 mmol/L，0.31 mmol/L，0.54 mmol/L，0.77 mmol/L，1.0 mmol/L，1.20 mmol/L，1.50 mmol/L，1.80 mmol/L，2.00 mmol/L的标准溶液。(2)TPTZ 工作液的配制:40 mmol/L HCl：取盐酸(12 mmol/L)100 L溶于30 mL蒸馏水；20 mmol/L TPTZ溶液：准确称取0.0624g TPTZ

37、溶解于10mL， 40 mmol/L HCl；0.3mol/L，pH=3 .0醋酸钠缓冲液：准确称取6.15g 无水乙酸钠溶于250 mL 蒸馏水，并用12 mmol/L的浓盐酸调至pH=3.0；20 mmol/L FeCl3 溶液：准确称取0.0324g FeCl3(无水)溶于10 mL醋酸钠缓冲液；TPTZ工作液：取2.5mL 20 mmol/L TPTZ溶液，2.5mL 20 mmol/L的FeCl3溶液及25mL醋酸钠缓冲液(pH=3.0)混合均匀，避光并封口于37水浴中孵化30min，即配即用。(3)标准曲线的制定： 取上述不同浓度的标准溶液各0.1ml，TPTZ 工作液0.9ml及

38、醋酸钠缓冲液9.0ml 于10mL试管，避光并封口于37水浴中反应30min，于596nm处测定其吸光度值(每组3个平行)。以吸光度值为纵坐标，水溶性维生素E的浓度(mmol/L)为横坐标，得到的标准曲线为A=0.3317B +0.0444，R2=0.9993。式中A为吸光度值，B为水溶性维生素E的浓度。(4)样品抗氧化性的测定：准确称取不同质量的样品，用甲醇溶解并定容至25mL，得到浓度均为1.0 mmol/L的溶液；取0.1mL样品溶液，TPTZ 工作液0.9ml及醋酸钠缓冲液9.0mL于10mL试管，避光并封口于 37水浴中反应30min，于596nm处测其吸光度(每种样品3个平行)；用

39、水溶性维素E(Trolox)做标准品，根据标准曲线计算结果用Trolox 当量表示mmol/g)，即每克样品干重抗氧化能力相当于Trolox 的毫摩尔数。 2.3.6数据分析实验数据以三次实验的平均值±SD 表示。3实验结果与讨论3.1荞麦麸皮粗提液的液相色谱析甜荞麸皮多酚的粗提液经HPLC-MS分析，在320nm和280nm检测出15种主要成分，液相图见图1，各物质的保留时间、质荷比以及对应化合物在表2中列出。图1甜荞麸皮粗提液的HPLC图表2 甜荞麸皮粗提液中各组分的保留时间、质荷比及对应的化合物序号保留时间(min)m/z化合物112.187341.2/819.2未知215.0

40、54267.0/535.0未知317.622651.2未知418.771289.0原儿茶素522.792341.4咖啡酸己糖624.079473.2未知725.438487.2咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷826.994289.0原儿茶素929.184487.2咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷1030.896441.7/883.4表儿茶素-没食子酸1133.666586.4未知1236.370692.3未知1339.906741.3未知1444.887609.3芦丁1546.657469.1未知由图1和表2可以看出，荞麦麸皮中多酚种类比较复杂，主要物质为1、2、7、10、13号峰，其中有许多

41、在现有的报道中均为出现的成分。7号峰无论在320nm还是280nm下均是甜荞壳多多酚中最主要的物质，该化合物的质荷比(m/z)为487.2，对照之前的报道9，7号峰对应的物质可能为1-O-咖啡酰-6O-吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷。在之后的实验中，我们将对咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷的分离纯化进行研究，分析甜荞麸皮中主要多酚的抗氧化活性。3.2大孔树脂分离纯化利用大孔树脂柱层析，并用水、40%甲醇、60%甲醇和70%丙酮作为洗脱剂对甜荞麸皮多粗提液进行梯度洗脱，得到A1、A23、A4四个主要成分不同的组分如图2，其中主要物质7号峰在40%甲醇中被洗脱下来，即组分A2，图3为A2组分的液相分析

42、图。图2 大孔树脂分离流程图3甜荞麸皮经大孔树脂分离后A2组分的HPLC图由图3我们可以看出，经过大孔树脂的粗分离，粗提液中的部分主要多酚组分已经被分离开，A2组分中的主要成分除了分离目产物7号峰还有2、6、10号峰。可以看出只用大孔树脂无法纯化咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷，在下面的实验中我们将利用聚酰胺树脂进一步使7号峰得到分离。3.3聚酰胺分离纯化将经大孔树脂粗分离得到的组分A2用聚酰胺进一步分离纯化，分别用水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、80%甲醇和95%甲醇进行洗脱，得到B1、B2、B3、B4四个主要成分的组分，分离过程。目标分离产物1-O-咖6-O-吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄

43、主要在水即组分B2中被洗脱下来。B1-B4组分的液相图分图5、图6、图7和图8。图4聚酰胺分离流程图5 B1组分的HPLC图图6 B2组分的HPLC图图7 B3组分的HPLC图图8 B4组分的HPLC图由图5、6、7、8可知， B1组分中主要是峰1、2、4、9等物质，B2组分中主要包含目标产物7号峰，B3组分中除了7号峰，还包含杂质峰2、5、6、9，B4组分中主要是保留时间靠后的一些杂质峰。由此可知聚酰胺的分离已进步使7号峰从2、4、5、9号峰中纯化出来，但是B2组分中依然还存在主要的杂质峰2，在下面的实验中我们还需要选择其他的柱材料使7号峰咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷得到最终的纯化。3.

44、4 Sephadex-LH 20葡聚糖的分离纯化经大孔树脂和聚酰胺树脂纯化的B2组分再利用Sephadex-LH 20葡聚糖凝胶进一步分离，用水、10%甲醇、30%甲醇和50%甲醇进行洗脱，洗脱流程见图8。B2组分聚糖分离得到C1、C2、C3三个主要成分不同的组份，通PLC液相检测发现目标产物咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷主要出现在水的洗脱液中，即组分C1中，C1组分的液相图见图9。图9 Sephadex-LH 20葡聚糖分离流程图10 C1组分的HPLC图如图10，经过Sephadex-LH 20葡聚糖凝胶进一步分离，C1组分中的咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷在HPLC中的纯度达到95%

45、以上，已经达到纯化。3.5 咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷的抗氧化性分析在上文中分别经过大孔树脂、聚酰胺和Sephadex-LH20葡聚糖的分离纯化，我们已经将甜荞麸皮中的咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷成功分离出来。Vito Verardo等人曾在甜荞中鉴定出咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷，其结构中的糖苷键是由咖啡酸的羧基以及葡萄糖上的一个羟基所形成。图11为咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷和其苷元咖啡酸的结构式。将咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷和咖啡酸进行抗氧化性比较，我们可以研究糖苷对酚酸抗氧化性的影响。 图11 咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷和咖啡酸的结构图表3咖啡酸和 咖啡酰

46、吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷抗氧化能力比较样品 抗氧化能力mmol(Trolox)/mmol(样品) DPPH值 FRAP值咖啡酸0.643±0.0020.964±0.005咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷0.099±0.010.131±0.003由表3可以看出，DPPH和 FRAP结果是一致的，咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷的抗氧化性要远低于咖啡酸，这说明糖苷会使酚酸的抗氧化性降低。由于多酚类化合物的抗氧化活性与分子的酚羟基数量有很大关系，酚羟基越多，抗氧化性越强，如果咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷的结构式如图11所示，即咖啡酸中的羟基与糖环中的羟基

47、形成糖苷键，则其抗氧化性应不会与咖啡酸有巨大的区别。由表3中可以看出，啡酸的抗化性要远远大于咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷，所以我们猜测纯化产物中咖啡酰中酚羟基与糖环中的羟基形成了糖苷键，导致纯化产物的抗氧化性远低于咖酸。纯化产物可能的结构如图12所示。 图12 纯化产物的结构推测图12是根据抗氧化实验结果推测出的纯化产物7号峰的结构式，由于研究的时间有限，其具体结构还需在之后的实验中通过更加严谨的方法去验证。4结论与展望1、甜荞麸皮的多酚提取物中共鉴定出15种主要成分，其中最主要的组分为咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷。2、多种柱层析方法联用分离甜荞麸皮中的咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷

48、。在大孔树脂柱层析中目标分离产物主要在40%甲醇中被洗脱出来，在聚酰胺和葡聚糖柱层析中目标分离产物均在水中被洗脱出来。先后分别经过大孔树脂、聚酰胺和葡聚糖柱层析分离，咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷从甜荞麸皮多酚中纯化出来。3、利用DPPH和FRAP方法对纯化出的咖啡酰吡喃鼠李糖苷-吡喃葡萄糖苷和其苷元咖啡酸进行抗氧化比较，发现纯化产物的抗氧化性远远低于咖啡酸，由此推断纯化产物中糖苷键是由咖啡酰中的酚羟基与糖环中的羟基形成的。5参考文献1李丹,丁霄霖.荞麦生物活性成分的研究进展(2)J.西部粮油科技，2005,7(21): 38-41.2付美云,周立祥.植物多酚在环境保护与农业生产中的应用J.用生态学报,2004,14(9):1673-1677.3石碧,狄莹.植物多酚D.北京:科学出版社,2000,5(13):46-48.4陈曾三.第七营养素植物多酚功能性及其开发利用J.粮食与油脂,2000,9(30):40-42.5Stanislaw Burda,Wieslaw Oleszek,Chang