骨髓检查及细胞化学染色检验

1、骨髓检查及细胞化学染色检验骨髓检查及细胞化学染色检验湖南省第二人民医院 邹国英 85232281髓检查及细胞化学染色检验骨髓检查及细胞化学染色检验掌握：掌握： 常用细胞化学染色（过氧化物酶染色、过碘酸常用细胞化学染色（过氧化物酶染色、过碘酸- -雪夫染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色、氯雪夫染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色、氯乙酸乙酸AS-D萘酚酯酶染色、中性非特异性酯酶萘酚酯酶染色、中性非特异性酯酶染色、碱性染色、碱性-丁酸萘酚酯酶染色、酸性磷酸酶丁酸萘酚酯酶染色、酸性磷酸酶染色、酯酶双染色、骨髓铁染色）的原理、方染色、酯酶双染色、骨髓铁染色）的原理、方法、结果分析和临床

2、意义。法、结果分析和临床意义。骨髓检查及细胞化学染色检验骨髓检查及细胞化学染色检验熟悉：熟悉：正常血细胞对化学染色的反应。正常血细胞对化学染色的反应。骨髓检查及细胞化学染色检验骨髓检查及细胞化学染色检验了解：了解：流式细胞仪的构造、原理、主要技术指标和临床应用。流式细胞仪的构造、原理、主要技术指标和临床应用。 染色体分析在临床血液学中的应用。染色体分析在临床血液学中的应用。 分子生物学检查在血液学中的应用。分子生物学检查在血液学中的应用。常用常用FISH技术的种类、原理、方法和临床应用。技术的种类、原理、方法和临床应用。常用造血干常用造血干/祖细胞培养的种类、原理和临床应用。祖细胞培养的种类、

3、原理和临床应用。非显带染色体和显带染色体相关概念和技术。常见染色体数目非显带染色体和显带染色体相关概念和技术。常见染色体数目和结构异常的有关概念和表示方法。核酸分子杂交技术原理和和结构异常的有关概念和表示方法。核酸分子杂交技术原理和方法。聚合酶链反应原理和常用方法。聚合酶链反应原理和常用PCR产物检查方法。以产物检查方法。以PCR为为基础的相关技术。基因芯片技术。基础的相关技术。基因芯片技术。细胞凋亡概念，细胞凋亡形态学的基本变化及主要生物化学特细胞凋亡概念，细胞凋亡形态学的基本变化及主要生物化学特征。细胞凋亡的机制。征。细胞凋亡的机制。细胞化学染色检验细胞化学染色检验细胞化学染色细胞化学染色

4、，是一种以，是一种以细胞形态学细胞形态学为基础，结合为基础，结合运用运用化学反应的原理化学反应的原理对血对血细胞内的各种化学物质作细胞内的各种化学物质作定位定位、定性定性及及半定量半定量分析分析的方法。的方法。细胞化学染色检验细胞化学染色检验血细胞化学染色的基本要求是血细胞化学染色的基本要求是在在原位原位显示细胞成分和结构，显示细胞成分和结构，反应产物应是反应产物应是有色沉淀物有色沉淀物，具，具有一定的有一定的稳定稳定性。性。血细胞化学染色可显示血细胞化学染色可显示糖原糖原、脂类脂类、酶酶、蛋白质蛋白质等。等。细胞化学染色检验细胞化学染色检验基本步骤基本步骤固定固定：蒸汽、液体固定：蒸汽、液体

5、固定有色沉淀反应有色沉淀反应：偶氮偶联：偶氮偶联法、普鲁士蓝反应、雪夫法、普鲁士蓝反应、雪夫反应、联苯胺法反应、联苯胺法复染复染细胞化学染色检验细胞化学染色检验临床意义临床意义辅助判断急性白血病的细胞类型辅助判断急性白血病的细胞类型辅助血液系统疾病的诊断和鉴别诊断辅助血液系统疾病的诊断和鉴别诊断观察疾病疗效和判断预后观察疾病疗效和判断预后 探讨某些疾病的发病机制探讨某些疾病的发病机制 一、过氧化物酶染色（一、过氧化物酶染色（POX）原理：原理：粒细胞和单核细胞胞浆中含有的髓粒细胞和单核细胞胞浆中含有的髓过氧化物酶（过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）能将底物过氧化氢分解，产）能

6、将底物过氧化氢分解，产生新生态氧，它将四甲基联苯胺氧生新生态氧，它将四甲基联苯胺氧化为联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢化为联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢氧化，显棕色四甲基苯醌二胺，再氧化，显棕色四甲基苯醌二胺，再加入亚硝基铁氰化钠与联苯胺蓝结加入亚硝基铁氰化钠与联苯胺蓝结合，可形成稳定的蓝色颗粒，定位合，可形成稳定的蓝色颗粒，定位于细胞浆内酶所在的部位。于细胞浆内酶所在的部位。POX结果判断结果判断细胞质内有细胞质内有蓝黑色颗粒蓝黑色颗粒者为阳性。者为阳性。（）（） 无颗粒沉着无颗粒沉着；（；（a）（） 颗粒细小颗粒细小 ，分布稀疏，分布稀疏；（b）（+ +） 颗粒较粗，局灶分布颗粒较粗，局灶分布；（c

7、） （+） 颗粒粗大，分布较密，颗粒粗大，分布较密，占胞质占胞质 1/22/3 1/22/3 ；（；（d）（+） 颗粒粗大，呈团块分布颗粒粗大，呈团块分布；（e）（+） 全部胞质均部满颗粒，全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核可覆盖胞核（f） 。各种细胞过氧化物酶染色各种细胞过氧化物酶染色 嗜碱粒细胞嗜酸性粒细胞原幼粒细胞骨髓片POX染色临临床床意意义义 POX染色是辅助诊断急性白血病细胞类型的染色是辅助诊断急性白血病细胞类型的首选、最重要首选、最重要的细胞化学染色。的细胞化学染色。（1 1）粒系粒系：POX主要分布在主要分布在粒细胞粒细胞和和单核细胞单核细胞内，随着粒细胞内，随着粒细胞成熟成熟的程

8、度而逐的程度而逐渐增强，中性分叶核粒细胞为渐增强，中性分叶核粒细胞为强强阳性阳性。 嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞阳性程度阳性程度最强最强，其阳性颗粒比中性粒细胞粗大，有折光。，其阳性颗粒比中性粒细胞粗大，有折光。 嗜碱性粒细胞嗜碱性粒细胞为为阴性阴性。（2 2）单核细胞单核细胞： 原始单原始单核细胞为核细胞为阴性阴性反应，反应， 幼稚单幼稚单核细胞和核细胞和成熟单成熟单核细胞呈核细胞呈弱阳性弱阳性反应，颗粒细小，弥散分布。反应，颗粒细小，弥散分布。临临床床意意义义（3 3）其他细胞淋巴其他细胞淋巴细胞、细胞、浆浆细胞、细胞、幼红幼红细胞、细胞、组织组织细细 胞、胞、巨核巨核细胞均呈细胞均呈阴性阴性

9、反应。反应。（4 4）血小板过氧化物酶血小板过氧化物酶主要定位于主要定位于幼稚型幼稚型巨核细胞的核膜上，可作为原巨核细胞的一种巨核细胞的核膜上，可作为原巨核细胞的一种标志物，有助于标志物，有助于FAB M7的识别。的识别。临临床床意意义义骨髓片POX染色APL：呈强阳性反应AML-M4：部分呈阳性反应， 部分成弱阳性反应AML-M5：呈弱阳性ALL：呈阴性，10个铁颗粒。个铁颗粒。 正常范围：正常范围：12% 44% ，平均，平均21.4%， 多见多见型，少见型，少见型，无型，无、型型。细胞内铁细胞内铁结果判断结果判断（3）环形铁粒幼红细胞环形铁粒幼红细胞： 指含铁颗粒指含铁颗粒6个个，其中，

10、其中1/2以上以上铁颗粒铁颗粒围绕核周排列成完整环形或不完整围绕核周排列成完整环形或不完整环形环形。 正常或非铁粒幼细贫血正常或非铁粒幼细贫血无无环形铁粒幼细胞，环形铁粒幼细胞，铁粒幼细贫血铁粒幼细贫血中环形铁粒幼中环形铁粒幼细胞细胞6%环形铁粒幼细胞环形铁粒幼细胞 临床意义临床意义1缺铁性贫血缺铁性贫血时，时，骨髓细胞外铁明显减少，为骨髓细胞外铁明显减少，为“一一”“士士”，细胞内铁平均，细胞内铁平均5.9%，仅，仅为为I型。经有效铁剂治疗后，外铁增多。因此骨髓铁染色是诊断型。经有效铁剂治疗后，外铁增多。因此骨髓铁染色是诊断缺铁性缺铁性贫血贫血及指导及指导铁剂治疗铁剂治疗的重要方法。的重要方

11、法。2铁粒幼细胞性贫血铁粒幼细胞性贫血时，时，外铁外铁“2”一一“3”，内铁平均，内铁平均70%，其铁粒粗大，以，其铁粒粗大，以 型型为为主，出现较多环形铁粒幼细胞。因此，本实验是诊断主，出现较多环形铁粒幼细胞。因此，本实验是诊断铁粒幼细胞贫铁粒幼细胞贫血血的有效方法。的有效方法。MDS也可出现环形铁粒幼细胞。也可出现环形铁粒幼细胞。 3. . 非缺铁性贫血非缺铁性贫血如巨幼细胞贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等骨髓铁正常或不同程度如巨幼细胞贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等骨髓铁正常或不同程度的增加。但再生障碍性贫血不会出现环形铁粒幼细胞，可作为与的增加。但再生障碍性贫血不会出现环形铁粒幼细

12、胞，可作为与MDS鉴别鉴别的参考。的参考。 4. . 继发性贫血的部分患者细胞内铁可减少，但细胞外铁不减少。继发性贫血的部分患者细胞内铁可减少，但细胞外铁不减少。 五、过碘酸五、过碘酸-雪夫染色（雪夫染色（PAS）原理：原理：过碘酸过碘酸-雪夫（雪夫（Periodic acid-schiff，PAS）染色）染色又称糖原染色。胞浆内又称糖原染色。胞浆内存在的糖原或多糖类物存在的糖原或多糖类物质（如粘多糖、粘蛋白、质（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖酯等）中的糖蛋白、糖酯等）中的乙 二 醇 基 （乙 二 醇 基 （ C H O H -C H O H ） 经 过 碘 酸） 经 过 碘 酸（Periodi

13、c acid）氧化，）氧化，转变为二醛基（转变为二醛基（CHO-CHO），与雪夫（），与雪夫（Schiff）试剂中的无色品红结合，试剂中的无色品红结合，形成紫红色化合物而沉形成紫红色化合物而沉积于胞浆中糖原类物质积于胞浆中糖原类物质所存在的部位。该反应所存在的部位。该反应称为过碘酸称为过碘酸-雪夫（雪夫（PAS）阳性反应。阳性反应。 PAS结果判断结果判断细胞质内有出现细胞质内有出现红色颗粒、块状红色颗粒、块状或呈弥漫状红色或呈弥漫状红色者为阳性。者为阳性。（）胞质无色，无颗粒。（）胞质无色，无颗粒。（+）胞质淡红色或有少量红）胞质淡红色或有少量红色颗粒，通常色颗粒，通常10个颗粒。个颗粒。（

14、+）胞质红色或有）胞质红色或有10个以上个以上红色颗粒。红色颗粒。（+）胞质呈暗红色或有粗）胞质呈暗红色或有粗大红色颗粒，可出现红色大红色颗粒，可出现红色块状。块状。（+）胞质呈紫红色或有粗）胞质呈紫红色或有粗大红色块状。大红色块状。 临床意义临床意义（1）M6与巨幼贫的鉴别与巨幼贫的鉴别 M6的幼红细胞的幼红细胞PAS可呈可呈强阳性强阳性，积分明，积分明显增高，显增高，巨贫巨贫、再障、溶贫时、再障、溶贫时PAS反应为反应为阴阴性性。（2）急性白血病的类型鉴别）急性白血病的类型鉴别 ALL，PAS呈大块状阳性，也可是阴性，呈大块状阳性，也可是阴性，AML为为阴性阴性，急性单核细胞白血病时，急性

15、单核细胞白血病时原单原单核细胞及核细胞及幼单幼单核细胞核细胞PAS阳性阳性，积分增高，积分增高，阳性颗粒小而多，呈弥散分布。阳性颗粒小而多，呈弥散分布。PAS染色AML-M6幼红细胞呈阳性反应MA幼红细胞呈阴性反应ALL-L1L1 PAS(+)AML-M5M5 PAS(+)AML-M6AML-M6 PAS(+)AML-M7M7 PAS(+)（3）巨核细胞和）巨核细胞和Sternberg细胞鉴别细胞鉴别 巨核巨核细胞细胞PAS强阳性强阳性，Sternberg细胞为阴细胞为阴性或弱阳性。性或弱阳性。（4）戈谢氏细胞强阳性戈谢氏细胞强阳性，尼曼尼曼-皮克皮克细胞细胞阴阴性或弱阳性性或弱阳性。（5）淋

16、巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴细胞的糖）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴细胞的糖原积分增高；一般的病毒感染，糖原积分原积分增高；一般的病毒感染，糖原积分在正常范围内。在正常范围内。六、六、氯乙酸氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（萘酚酯酶染色（NAS-DCE）原理：原理：细胞内的氯乙酸ASD萘酚酯酶（naphythol AS-D chloroacetate esterase,NAS-DCE）水解基质液中的氯乙酸ASD萘酚，产生ASD萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所存在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的有色沉淀为红色。NASDCE几乎仅出现在粒细胞，其特异性高

17、，因此又称为“粒细胞酯酶”、“特异性酯酶”。结果判断结果判断阳性结果为胞质内出阳性结果为胞质内出现现红色红色沉淀沉淀（）胞质无色。（）胞质无色。（）胞质呈淡红色。（）胞质呈淡红色。（）鲜红色沉淀（）鲜红色沉淀布满胞质。布满胞质。（）深红色沉（）深红色沉淀充满胞质。淀充满胞质。 临床意义临床意义 1急性粒细胞白血病和急性早幼粒细胞白急性粒细胞白血病和急性早幼粒细胞白血病原粒细胞血病原粒细胞NASDCE染色多呈（）染色多呈（）（）。白血病性早幼粒细胞呈（）（）。白血病性早幼粒细胞呈（）（）。（）。 2急性单核细胞白血病原、幼单核细胞急性单核细胞白血病原、幼单核细胞多呈阴性反应。多呈阴性反应。 3急

18、性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病 原、幼淋巴细胞呈原、幼淋巴细胞呈阴性反应。阴性反应。七、七、中性非特异性酯酶染色中性非特异性酯酶染色 原理：原理：中性非特异性酯酶包括醋酸AS-D萘酚酯酶(naphytholAS-D acetate esterase,NAS-DAE)染色和-醋酸萘酚酯酶（naphythyol acetate esterase , -NAE）染色。细胞内的-醋酸萘酚酯酶（naphythyol acetate esterase , -NAE）在pH中性的条件下水解基质液中的-醋酸萘酚，释放出-萘酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试

19、验常用的重氮盐为坚牢蓝B，形成的有色沉淀为棕黑色或灰黑色，-NAE存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，故它是一种中性非特异性酯酶。结果判断结果判断阳性结果为胞质内出现阳性结果为胞质内出现蓝色蓝色或棕黑色颗粒或棕黑色颗粒沉淀沉淀 （）无颗粒沉淀，为（）无颗粒沉淀，为0分。分。（）颗粒少量、稀疏，）颗粒少量、稀疏，为为0.5分。分。（）胞质内（）胞质内1/2区域出现区域出现颗粒沉淀，为颗粒沉淀，为1分。分。（）胞质内（）胞质内3/4区域出区域出现颗粒沉淀，为现颗粒沉淀，为2分。分。（）胞质内布满颗（）胞质内布满颗粒沉淀，为粒沉淀，为3分。分。（）胞质内充满（）胞质内充满浓密的颗粒沉淀，为浓密的颗粒

20、沉淀，为4分。分。 临床意义临床意义NASDAE染色属于中性非特异性酯酶染色，染色属于中性非特异性酯酶染色，在鉴别白血病类型时需同时做在鉴别白血病类型时需同时做NaF抑制试验。抑制试验。 1急性粒细胞白血病原粒细胞急性粒细胞白血病原粒细胞NASDAE染色染色可呈阳性反应，且不被氟化钠抑制。可呈阳性反应，且不被氟化钠抑制。 2急性早幼粒细胞白血病白血病性早幼粒细胞急性早幼粒细胞白血病白血病性早幼粒细胞NASDAE染色为阳性或强阳性反应，亦不被氟染色为阳性或强阳性反应，亦不被氟化钠所抑制。化钠所抑制。 3急性单核细胞白血病原、幼单核细胞急性单核细胞白血病原、幼单核细胞NASDAE染色多呈阳性或强阳

21、性反应，但能被氟化钠染色多呈阳性或强阳性反应，但能被氟化钠抑制抑制 骨髓骨髓NAS-DAE染色及氟化钠抑制反应染色及氟化钠抑制反应 细胞化学染色检验小结细胞化学染色检验小结急淋急粒急单红白血病各型急性白血病细胞的化学染色特征各型急性白血病细胞的化学染色特征 POX PAS NASPOX PAS NASDCE NASDCE NASDAE DAE （NaFNaF）NAPNAP急淋（急淋（L L1-1-L L3 3 ） (-) (+)(-) (+)(+) (-) (-)(+) (-) (-)(+) (+) 不抑制不抑制 急粒（急粒（M M1 1 M M2 2） (-)(-)(+) (-)(+) (-

22、)(+)(+) (+) (+)(+) (-)(+) (-)(+) (+) 不抑制不抑制急早幼粒（急早幼粒（M M3 3）(+)(+)(+)(+)(+)(+)(+) (+)(+) (+)(+) (+)(+) (+)(+) (+) 不抑制不抑制 急粒单（急粒单（M M4 4） (-)(-)(+)(+)(-)(-)(+) (-)(+) (-)(+) (+)(+) (+)(+) (+) 部分抑制部分抑制 或或急单（急单（M M5 5） (-)(-)(+) (-)(+) (-)(+) (-) (+)(+) (-) (+)(+) (+) 抑制抑制 或或红白血病（红白血病（M M6 6 ） (-) (+)(-) (+)(+) (-)(+) (-) (-) (-) 幼红细胞幼红细胞急巨（急巨（M M7 7） (-) (+)(-) (+)(+) (-)(+) (-)(-(-） 自学内容自学内容骨髓活检骨髓活检细胞因子的检验细胞因子的检验造血细胞培养检验造血细胞培养检验血细胞染色体检验和分子生物学检