《基因工程的基本操作程序》课件(新人教选修3)

1、1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取( (一一) )、目的基因主要是、目的基因主要是_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些（二）、获取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、

2、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成请阅读请阅读P9P9第一和二两段第一和二两段1.目的基因的获取目的基因的获取（1 1）直接从生物体中提取总）直接从生物体中提取总DNADNA，构构建建基因基因组组DNADNA文库文库(genomic DNA (genomic DNA library)library)，从中调用目的基因；，从中调用目的基因； 基因基因组组DNADNA文库的构建文库的构建 将总将总DNADNA经过酶解，分离不同长短的经过酶解，分离不同长短的DNADNA片段。片段。包包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转转

3、染细菌或体外包装到染细菌或体外包装到噬菌体噬菌体颗粒上颗粒上便构成了该生物便构成了该生物的的基因组文库。基因组文库。基因组文库的构建基因组文库的构建（2 2）. .基因文库的构建方法基因文库的构建方法通过对受通过对受体菌的培体菌的培养而储存养而储存基因基因 cDNA文库的构文库的构建建-反转录法：反转录法： 以目的基因转以目的基因转录成的信使录成的信使RNARNA为模为模板，反转录成互补板，反转录成互补的单链的单链DNADNA，然后在，然后在酶的作用下合成双酶的作用下合成双链链DNADNA，从而获得所，从而获得所需的基因。需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链DNADNA反转录

4、酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA( (目的基因目的基因) )cDNAcDNA( ( 互补互补DNA)DNA)：是由生物的某一特定器官或是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的特定发育时期细胞内的mRNAmRNA经体外反转录后形成的互补经体外反转录后形成的互补DNADNA片段，与载体连接后储片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的受体菌群就叫做这种生物的cDNAcDNA文库文库 2)cDNA2)cDNA文库文库 (cDNA(cDNA library library) )基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAmRNAc

5、DNAcDNA1 1、原核细胞的基因结构、原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子启动子：启动子：位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNADNA片断，片断，它是它是RNARNA聚合酶识别和结合的部位聚合酶识别和结合的部位，有了它才能，有了它才能驱驱动基因转录出动基因转录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终止能终止mRNAmRNA的转录的

6、转录不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列苷酸序列. .包括启动子和终止子包括启动子和终止子非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子2 2、真核细胞的基因结构、真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外

7、显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内不能够编码蛋白质的序列叫做内含子含子启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具有和具有调控作用的调控作用的_区组成的区组成的3 3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较、原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核

8、细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码基因组文库和部分基因组文库基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库文库)比较比较怎样从基因文库中得怎样从基因文库中得到我们所需的目的基到我们所需的目的基因呢因呢? ?依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性从基因文库中得到目的基因的方从基因文库中得到目的基因的方法法2 2、利用、利

9、用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ _ 、 _等等原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果：结果：多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增要有一段已知目的基因的核

10、苷酸序列（前提条件）要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）过程：过程：a a、高温变性、高温变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性55-6055-60）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链3、人工合成法：、人工合成法：基因较小，核苷酸序列已知，可以

11、基因较小，核苷酸序列已知，可以利用利用DNA合成仪人工合成合成仪人工合成二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建4 4、切割质粒和目的基因的限制性内切酶、切割质粒和目的基因的限制性内切酶 是否要求一样？为什么是否要求一样？为什么？2 2、表达载体至少带有哪些结构？各有什、表达载体至少带有哪些结构？各有什 么作用？么作用？思考：思考：3 3、构建表达载体时需要哪些工具？、构建表达载体时需要哪些工具？1 1、这步是基因工程的核心，构建基因、这步是基因工程的核心，构建基因 表达载体的目的是什么？表达载体的目的是什么？ 核心核心二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的

12、核心1、目的：、目的：所需物质：所需物质：使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定稳定存在，存在，并且可以并且可以遗传遗传给下一代，同时使目的给下一代，同时使目的基因能够基因能够表达表达和和发挥发挥作用。作用。它们各自它们各自的作用是的作用是什么什么?n启动子启动子：位于基因首端，：位于基因首端，nRNA聚合酶识别和结合聚合酶识别和结合 部位，启动转录部位，启动转录n终止子终止子：位于基因尾端，：位于基因尾端， 终止转录终止转录n标记基因标记基因：鉴别受体细胞：鉴别受体细胞 内是否含目的基因，内是否含目的基因， 从而将有目的基因从而将有目的基因 的细胞筛选出来的细胞筛选出来n目的基因目

13、的基因：外源：外源DNA分子的分子的有效片段。有效片段。1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_ _处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同( (二二).).过程过程载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因

14、的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方

15、式携带进去。注意注意三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞1 1、导入植物细胞常用的方法是什么？、导入植物细胞常用的方法是什么？ 原理是什么？具体过程是怎样的？原理是什么？具体过程是怎样的？3 3、导入大肠杆菌的方法是怎样的？、导入大肠杆菌的方法是怎样的？ 钙离子有什么作用？钙离子有什么作用？2 2、导入动物细胞常用的方法是什么？、导入动物细胞常用的方法是什么？ 基本操作程序是怎样的？基本操作程序是怎样的？三将目的基因导入受体细胞三将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化： （二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细

16、胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1.目的基因导入植物细胞：目的基因导入植物细胞： 目的基因进入受目的基因进入受体细胞内，在受体体细胞内，在受体细胞内维持细胞内维持稳定稳定和和表达表达的过程的过程A.转化的概念：转化的概念：B.B.农杆菌的特点农杆菌的特点 农杆菌易感双子叶和裸子植物，对大多数单子叶农杆菌易感双子叶和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感

17、染能力植物没有感染能力(1)农杆菌转化法农杆菌转化法C、原理：原理：Ti质粒上的质粒上的T-DNA可以转移到受体细可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上上。（2 2）过程）过程目的基因插入到目的基因插入到_,构建构建_, _菌菌 _细胞细胞 整合到整合到 _细胞的细胞的_上上, _.转入转入侵染侵染 优点优点:比较经济和有效比较经济和有效（2）基因枪法基因枪法（3）花粉管通道法花粉管通道法2.目的基因导入动物细胞（）方法（）方法: : 显微注射技术显微注射技术（）基本操作程序：（）基本操作程序：含有目的基因的表达载体含有目的基因的表达载体_显微注射显微

18、注射受精卵移植到雌性动物体的，受精卵移植到雌性动物体的，输卵管输卵管或子宫或子宫内内提纯提纯取卵取卵（）受精卵受精卵使发育成为具新现状的动物使发育成为具新现状的动物3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞（1）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少第一步：用第一步：用 _处理细胞，使细胞处于一种能吸处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中收周围环境中DNADNA分子的状态（分子的状态（_细胞）细胞）第二步：将溶于第二步：将溶于_缓冲液中与细胞缓冲液中与细胞混合，在一定温度下

19、促进混合，在一定温度下促进_细胞吸收细胞吸收DNADNA分子，分子，完成转化过程完成转化过程表达载体表达载体感受态感受态感受态感受态感受态感受态Ca2+将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNADNA上是否上是否插入

20、了目的基因插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交法分子杂交法 分子杂交技术分子杂交技术抗原抗体杂交法抗原抗体杂交法分子水平的检测分子水平的检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因.首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位素片段用放射性同位素等作标记等作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转

21、基因生物的基因组杂交,若显若显示出杂交带示出杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中（1）方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交幻灯幻灯片片 3737（2）过程）过程:DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍

22、然是两条游离的单链。 P P1515思考与探究思考与探究基因探针（基因探针（DNA探针）与目的基因杂交，有无探针）与目的基因杂交，有无杂交带杂交带2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法: :分分 子子 杂杂 交交方法方法: :抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若若出现杂交带出现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA检测二：个体生物学水平的鉴定检测二：个体生物学水平的鉴定 用棉铃饲喂棉铃虫，用棉铃饲喂棉铃

23、虫，如虫吃后不出现中毒症状，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。入了抗虫基因并得到表达。鉴定鉴定抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等归纳: 基因工程的基本操作程序1.1. 获取目的基因获取目的基因u 从基因文库从基因文库u 利用利用PCRPCRu 化学方法人工合成化学方法人工合成2.2. 构建基因表达载体构建基因表达载体u 目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3. 将目的基因导入受体细胞将目的

24、基因导入受体细胞u 农杆菌转化法、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法4.4. 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u 检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u 鉴定：鉴定：练习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所分子所用的限制性内切酶作用于图中的用的限制性内切酶作用于图中的 处

25、，处，DNA连接酶作用于连接酶作用于 处。（填处。（填“a”或或“b”）练习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，增为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。水稻新品系。（2）将重组）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法有农杆菌转化法和 法。法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用利用 技术，该技术的核心是技术，该技术的核心是 和和 。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交作探针进行分子杂交检测，又要用检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。的耐盐性。答案：（答案：（1）a a （2）基因枪）基因枪法（花粉管通道