戚豫-1--遗传病的实验室检查手段-超级简化版

1、遗传病的实验室检查手段进展遗传病的实验室检查手段进展北大医院实验中心北大医院实验中心戚豫戚豫 研究员研究员2022-6-1012007,Illumina推出推出Solexa; ABI推出推出SOLid 均能在均能在3天内完成天内完成1人的全基因组测序人的全基因组测序2022-6-1022022-6-10遗传病和基因的数量？遗传病和基因的数量？遗传病总数：14,861种(Online- Mendelian Inheritance in Man, OMIM, by 2015-3-21)人类基因总数：24,000个人类各种结构和功能蛋白：100,000种89种表型和基因全清楚；4,381种表现找到致

2、病突变意味着可做直接的基因诊断的病种很少！已知序列：10,391个基因可做间接诊断的很多！3“遗传病遗传病” 概念概念广义：所有疾病。因为一切人体正常生理功能广义：所有疾病。因为一切人体正常生理功能和病理状态都是由基因决定的和病理状态都是由基因决定的狭义：因基因突变而引发的疾病狭义：因基因突变而引发的疾病如何区分三个概念：如何区分三个概念：遗传性疾病：与环境因素引起的疾病对立遗传性疾病：与环境因素引起的疾病对立先天性疾病：可以是围产期感染先天性疾病：可以是围产期感染/药物所致药物所致家族性疾病：可能随着成员的迁出而终止家族性疾病：可能随着成员的迁出而终止2022-6-104发病频率发病频率总计

3、总计占我国出生人口占我国出生人口5.6%5.6%；为全球平均；为全球平均5 57 7倍倍每一项只占万分之几到千分之几每一项只占万分之几到千分之几按系统分类排名前按系统分类排名前5位：位：神经系统：智力低下、代谢障碍、癫痫神经系统：智力低下、代谢障碍、癫痫心血管系统：先心病心血管系统：先心病内分泌系统：糖尿病、肾上腺皮质增生内分泌系统：糖尿病、肾上腺皮质增生生殖系统：不孕不育生殖系统：不孕不育骨骼系统：多指骨骼系统：多指/趾趾-并指并指/趾、软骨发育不良趾、软骨发育不良2022-6-1052022-6-10先天性疾病的诱发因素先天性疾病的诱发因素遗传原因遗传原因后天环境所致，因素：后天环境所致，

4、因素： 物理：物理：X-ray、微波、超声波、热、微波、超声波、热 化学：砷、铅、汞（水俣病）等无机物；化学：砷、铅、汞（水俣病）等无机物； 橙剂、橙剂、EB（溴乙啶）等有机物（溴乙啶）等有机物 生物（感染）：生物（感染）：TORCH、EB、HIV、肝炎病毒等肝炎病毒等围产期因素诱变，但不肯定致病围产期因素诱变，但不肯定致病围产期因素只侵犯到个别器官，但注意与嵌合围产期因素只侵犯到个别器官，但注意与嵌合遗传（遗传（mosaic）区分）区分62022-6-10如何检出？如何检出？高危人群高危人群环境暴露环境暴露既往病史既往病史家族史家族史感染史感染史迁居情况迁居情况 遗传遗传 DNA/RNA 环

5、境环境无论外来病原体还是本身异常，无论外来病原体还是本身异常，遗传物质遗传物质的检测都是有效手段的检测都是有效手段72022-6-10实验室检测手段实验室检测手段, , 分辨率分辨率, , 和范围和范围染色体核型Karyotyping:109bp, 2800倍镜下可见荧光原位杂交FISH: 107bp, 一个基因的一部分多重探针连接扩增多重探针连接扩增MLPA:105bp,几十个基因比较基因组杂交CGH Array:105bp,几个基因间接基因诊断: 103105bp,一个或数个基因直接基因诊断PCR-Sequencing: 1bp, 一个基因Affymatric chip: 1bp, 数千个

6、基因, 半个基因组Genome-Wide-Sequencing: 1bp, 全部2.4万个基因注：bp, base pair, 碱基对82022-6-10从核型核型; FISH; array CGH; MLPA; 到CMA(chromosomal microarray analysis, 染色体微阵列,分子核型分子核型)细胞遗传学与分子遗传学相结合的方法细胞遗传学与分子遗传学相结合的方法临床细胞遗传学的历史是伴随着一系列识别染色体方法的技术进步发展临床细胞遗传学基本工作：核型分析 国内主要中期染色体核型，G显带在400条 国外高分辨染色体核型， G显带在1500条条件 ：细胞培养，光镜，核型分

7、析系统软件92022-6-101、染色体核型、染色体核型 Karyotyping基于显微镜下浓聚的染色体形态检查方法： G带、R带、Q带（550条，7组） 高分辨染色体分带（1500条） FISH（荧光原位杂交）：分裂间期染色体畸变种类： 数目异常（整倍和非整倍） 结构异常:-;+;t; del; ins; inv; dup; inv dup; fra(X)(q27.3):脆性X; der:衍生染色体; r(13):13号染色体呈环状（暗示有缺失）; i(Xq):等臂Xq102022-6-102 2、荧光原位杂交技术、荧光原位杂交技术FISH ( (fluorescence in situ h

8、ybridization,) )可以结合，但不依赖于核型分析单色与多色FISH，如SKY-FISH(光谱式多色染色体)是鉴别基因组发生较大缺失或重复金标准不足：一次杂交识别的范围有限需要很好的临床诊断或其他提示，花费大人力多，设备高级方法：探针标记，细胞或染色体的原位杂交条件：探针(cosmid)、 DNA 提取、PCR、真空干燥、图像采集与分析112022-6-10FISH需要条件需要条件荧光显微镜荧光显微镜+图像分析系统图像分析系统122022-6-103、多重探针连接扩增、多重探针连接扩增 MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplific

9、ation ) Schouten JP第一次描述一种基于PCR反应，通过毛细管电泳鉴定扩增产物是一种高分辨的，用于检测基因组序列拷贝数变异的方法 ( Nucleic Acids Res. 2002 Jun 15; 30(12): e57) 132022-6-10 同时检测40个基因组序列异常，几乎每个染色体2个 近端粒常有微缺失涉及不育、发育、智力，可一次查全仅需要20ng的DNA 能检测单个外显子exon的拷贝数, 探针辨认短的基因组序列,部分变性的DNA,如石蜡包埋,甲醛固定的样本均可使用 相对定量40个mRNA,鉴定启动子的甲基化状态,检测已知的突变和SNPS MLPA方法功能、特点方法

10、功能、特点142022-6-10MLPA反反应应过过程程152022-6-10MLPA结果判定结果判定相对峰域与对照相比减少相对峰域与对照相比减少35-50%判定缺失判定缺失相对峰域与对照相比增加相对峰域与对照相比增加35-50%判定重复判定重复突变突变/多态性位于探针的连接点或与探针的连接多态性位于探针的连接点或与探针的连接点很近也可能导致相对峰域减少点很近也可能导致相对峰域减少单一的外显子缺失需要其他方法证实单一的外显子缺失需要其他方法证实结果分析结果分析2例例162022-6-10172022-6-10182022-6-10MLPA需要条件PCR仪测序仪192022-6-104、比较基因

11、组杂交、比较基因组杂交 (Comparative genomic hybridization, CGH)什么是CGH: 1992年Kallioniemi创立的基于荧光标记和分子、细胞遗传学技术鉴定基因组DNA的获得、丢失和扩增，并且可以把这些遗传变异定位在正常的中期染色体上的一种技术特点: 在一个实验中，用一张中期染色体涂片分析全基因组的大的DNA序列拷贝数的不平衡改变(获得和丢失)，即因剂量的变化而不需要分裂的细胞缺点: 与测序相比分辨率不高，扩增子约2Mb，检出的缺失大小510Mb但也是个优点：容易辨识和解释 1997年Solinas-Toldo建立Microarrary/array-CG

12、H 目前最通用的是美国安捷伦公司(Agilent)的平台，已成为国际上遗传病诊断、流产组织分析和种植前诊断PGD的第一线手段(first-line)202022-6-10MicroarraynBACs/PACsnDNA探针固定在玻璃片上探针固定在玻璃片上nArrayed by robotically printing DNA onto slidesnAgilent scannerOld array-CGH212022-6-10Patient 2This patient presented to the Laboratory at 12 months of age with infantile

13、spasms and developmental delay. His head circumference was below the 2nd centile and weight was between the 10 to 25th centile. Seizures continued daily. At a review at 32 months brachycephaly, low anterior hairline, hypertelorism, and a large protruding tongue were some of the additional features o

14、bserved. Subtelomeric FISH revealed a deletion of the distal 9q probe PAC112N13. Array-CGH showed the patient has a 1.5-1.8 Mb deletion of distal 9q. Further FISH evaluation established the deletion as 1.7Mb with breakpoints between the BAC clones RP11- 83N9 and RP11-695L17.222022-6-1011q duplicatio

15、n 10q deletionPatient 5Male patient who presented at 18 years of age with intellectual disability, autism and dysmorphic features. Subtelomere FISH showed a unbalanced translocation, with an additional copy of the 11q probe PAC770G7 present on distal 10q. The distal 10q probe PAC137E24Gwas not prese

16、nt.232022-6-10New array-CGH?用不同的颜色荧光标记等量病人的测试和参用不同的颜色荧光标记等量病人的测试和参照照 DNA加入加入 Human Cot1DNA在在Microarray上进行杂交上进行杂交 杂交后洗去未结合的和错配的杂交后洗去未结合的和错配的靶靶 DNA高分辨扫描仪芯片高分辨扫描仪芯片242022-6-10双色激光扫描n红色 CY5n绿色 CY3F 值产生 reference DNApatient=25真实扫描芯片图(8X60K 芯片)分析软件界面2022-6-1026Cyto report: 给出23条染色体图和分析表格（列出部分）2022-6-10272

17、022-6-10什么是基因诊断？什么是基因诊断？狭义：针对致病基因的突变分析是一种直接的诊断扩展：利用致病基因的多态性(polymorphism) ；或利用相邻的多态性标记(polymorphic markers)进行连锁分析是一种间接的诊断广义：通过对疾病发生的基础，包括复制(DNA)、表达(RNA)和翻译(蛋白质)加以全过程分析所做出的诊断282022-6-10基因诊断技术基础基因诊断技术基础:PCR聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) :1985年发明,1992诺贝尔奖试管在热循环仪(PCR仪)中反应几小时，待测基因片段，专一地扩增上百万倍PCR

18、过程：加热变性：加热变性：分开模DNA双链冷却复性：冷却复性：使引物与目标序列特异结合 保温延长：保温延长：使引物按模板序列延长292022-6-10PCRPCR产物检测产物检测PCRPCR反应场所反应场所 以及以及302022-6-10不适合做不适合做PCR诊断的病种诊断的病种染色体病大片段基因缺失和重排所致的遗传病： 解决办法：细胞遗传学，荧光原位杂交FISH、多重探针连接扩增MLPA、比较基因组杂交CGH、基因芯片Affymatric array和大规模全基因组测序基因巨大(Megabases)且无热点突变的遗传病：NF1、DMD、BMD、ADPKD etc. 解决办法：杂交、酶学、代谢

19、产物、功能分析，截短蛋白分析法(Protein Truncation Test, PTT)、色谱、串联质谱312022-6-10哪些遗传病可以做基因诊断哪些遗传病可以做基因诊断? 需要查阅OMIM遗传病数据库()322022-6-10哪些遗传病可以做基因诊断哪些遗传病可以做基因诊断? 基因诊断适用范围和必要性基因诊断适用范围和必要性有器官组织差异性而不适合做组织活检的遗传病：有器官组织差异性而不适合做组织活检的遗传病：long QT等心脏病、糖原累积症I型(von Gierke型)、癫痫等脑病诊断后可以治疗或提前预防发病的遗传病：诊断后可以治疗或提前预防发病的遗传病

20、：如PKU、肝豆状核变性和G6PD缺乏症可以进行产前基因诊断的严重的先天代谢病，严重的精可以进行产前基因诊断的严重的先天代谢病，严重的精神疾患或恶性早期致死性疾病：神疾患或恶性早期致死性疾病：如性别畸形和性发育异常而找不到染色体异常。可通过选择性流产加以预防传统方法不能诊断、诊断不确切的家族性疾病：传统方法不能诊断、诊断不确切的家族性疾病：多以常显、X连锁和母系方式遗传。可做连锁分析332022-6-10例如例如: :家族性氨基甙类药物耳聋家族性氨基甙类药物耳聋对对氨基甙类如氨基甙类如卡那霉素、丁胺卡那、庆大霉卡那霉素、丁胺卡那、庆大霉素、新霉素以及链霉素等超级敏感素、新霉素以及链霉素等超级敏

21、感条件致病条件致病使用氨基甙类药物使用氨基甙类药物母系遗传母系遗传线粒体线粒体DNA上编码上编码12S rRNA的的基因存在致病突变基因存在致病突变A1555G一旦发现，可对全家进行该突变的筛查一旦发现，可对全家进行该突变的筛查发布用药禁忌发布用药禁忌342022-6-10 -1(先证者先证者) -2 -3 -4 AG: 线粒体线粒体mtDNA1555AG基因诊断基因诊断( ：有突变：有突变)II-1 -2 -3 -4氨基甙类耳毒家系的基因诊断示意图氨基甙类耳毒家系的基因诊断示意图I-1 I-2352022-6-10例例2 线粒体病的基因诊断线粒体病的基因诊断mitochondrion线粒体是

22、细胞的能量工厂线粒体是细胞的能量工厂362022-6-10Leigh病病- 亚急性坏死性脑脊髓病亚急性坏死性脑脊髓病严重性：在我院儿科临床诊断的严重性：在我院儿科临床诊断的3535例中，死亡例中，死亡2929例（例（83%83%）。目前生存仅仅）。目前生存仅仅6 6例。例。LeighLeigh病是一种线粒体病，但仅仅有病是一种线粒体病，但仅仅有20%20%由由mtDNAmtDNA突变突变所致，突变突变所致，80%80%由核基因突变所导致。由核基因突变所导致。基因检查：基因检查：mtDNAmtDNA突变检出率极低突变检出率极低229229临床临床诊断病例中仅仅检出诊断病例中仅仅检出3 3例：例：

23、T8993C 2T8993C 2例和例和T8993G1T8993G1例（死后尸解结果例（死后尸解结果mtDNA Mut%mtDNA Mut%：血：血=85%;=85%;肌肉肌肉=94%;=94%;脑脑=98%=98%；其母外周血；其母外周血=10%=10%）372022-6-10病例1、临床表现男，男，4月，主因精神发育倒退、惊厥入院月，主因精神发育倒退、惊厥入院第一胎，孕第一胎，孕9月疑潜在性缺氧行剖宫产，生后无窒息；月疑潜在性缺氧行剖宫产，生后无窒息；2月内发育如常，后出现倒退，表现为颈部发软、四肢活月内发育如常，后出现倒退，表现为颈部发软、四肢活动差、吸吮能力减弱、低热、阵发性呼吸暂停（

24、动差、吸吮能力减弱、低热、阵发性呼吸暂停（28次次/日）日）检查：间断抽搐，四肢肌力、肌张力低下，病理征检查：间断抽搐，四肢肌力、肌张力低下，病理征(-)。血乳酸高、代谢性酸中毒。血乳酸高、代谢性酸中毒。EEG示左侧为主的多灶尖波、示左侧为主的多灶尖波、棘波、多棘波和棘慢波。棘波、多棘波和棘慢波。MRI 示缺血改变：双侧壳核、示缺血改变：双侧壳核、丘脑区异常信号；脑白质发育落后。两次眼底检查未见丘脑区异常信号；脑白质发育落后。两次眼底检查未见异常呼吸节律不整，死前突然出现叹气样呼吸异常呼吸节律不整，死前突然出现叹气样呼吸父父31岁、母岁、母30岁，均无遗传病家族史岁，均无遗传病家族史38202

25、2-6-10392022-6-10402022-6-10方法方法PCR扩增扩增mtDNA8791-9413片段片段(622bp)分别用限制性内切分别用限制性内切酶酶MspI和和SmaI酶酶解解PCR产物产物2.5%琼脂糖凝胶电琼脂糖凝胶电泳分离酶解片段泳分离酶解片段对对EB染色的片段进染色的片段进行密度扫描，突变行密度扫描，突变比例（比例（Mut%）=突突变新增片段密度变新增片段密度/原原有片段残留密度有片段残留密度+突变新增片段密度突变新增片段密度结果结果患儿体内存在高患儿体内存在高比例的比例的8993TG突变突变患儿患儿1亲属中母亲属中母亲含较低比例的亲含较低比例的同样突变同样突变患儿患儿

26、1肌和脑组肌和脑组织病理检查符合织病理检查符合婴儿型婴儿型Leigh综综合征诊断合征诊断患儿患儿1 MRI示脑示脑缺氧性改变缺氧性改变M 患儿肌肉患儿肌肉 患儿血患儿血 母亲母亲 阴性对阴性对412022-6-10T8993GT8993C422022-6-10432022-6-10病理改变：灰质为主的海绵样改病理改变：灰质为主的海绵样改变，神经细胞坏死和毛细血管增变，神经细胞坏死和毛细血管增生。陈旧病变出现胶质细胞增生生。陈旧病变出现胶质细胞增生，新鲜病变存在格子细胞。，新鲜病变存在格子细胞。脑干脑干黑质、舌下神经核、面神经核和黑质、舌下神经核、面神经核和前庭神经核在不同病人均受累前庭神经核在

27、不同病人均受累。其他部位病变其他部位病变可以可以仅限于脑干，仅限于脑干，也也可以同时累及可以同时累及脊髓灰质脊髓灰质、基底基底节节、大脑和小脑皮层大脑和小脑皮层以及以及白质白质。442022-6-10“间接法”基因诊断连锁分析 例：苯酮尿症(PKU)的诊断致病基因：苯丙氨酸羟化酶PAH方法：细菌抑制实验(筛查) 苯丙酮酸和PAH定量基因诊断困难 70多种突变 基因大，突变很分散 检测突变成本高，周期长直接检测突变或连锁分析?452022-6-10连锁分析方法产前诊断PKU选择几对染色体标记(marker) A B 连锁分析示意连锁分析示意图图需要多态性标记（与需要多态性标记（与PAH基因基因在

28、染色体上的距离越近越好）在染色体上的距离越近越好）对先证者对先证者(BB)及家系成员及家系成员(父父-AB;母母-BC;胎儿胎儿-AC)的标记进的标记进行分型行分型(genotyping)胎儿胎儿-AC：不受累！：不受累！连锁诊断准确度：连锁诊断准确度：marker与致与致病基因的连锁程度病基因的连锁程度有有1%的交换率，理论可信度为的交换率，理论可信度为99%C 462022-6-10产前基因诊断对象：胎儿的DNA、代谢产物或酶蛋白取材：绒毛(8周)、羊水(16周)、胎儿静脉血手段： 针对代谢产物：HPLC、GC-MS(有组织特异性) 酶活性：特异性人工底物显色(有组织特异性) 针对基因：R

29、FLP、PCR等 (无组织特异性)要求：双取样、双方法、有资质、有质控准入：目前北京7家，专家委员会审核和年审管理:北京市产前诊断与产前筛查工作规范 产前诊断技术管理办法47体细胞嵌合的遗传病（生殖细胞嵌合异常比例过低也不行）组织器官异质性过大（线粒体病）国家法律和行业规定不允许的范围，如“天才基因”儿的选择（遗传不平衡）性别鉴定（除非性连锁疾病）呈数量遗传的多基因病或遗传相关的复杂遗传病以及没有做好准备的家庭2022-6-10哪些病不适合产前基因诊断48 非侵入性产前检查NIPT血浆游离DNA突变检测技术 TTTTCTTTTC c.2383 CT c.2383 CT c.4005 delG

30、c.4005 delGG2671*2022-6-1049母体血浆中的胚胎DNALo YM et al. Fetal cf-DNA detected via Y chromosome, Lancet 1997胎儿游离DNA：cell-free fetal DNA(cff DNA)母体外周血含有cffDNA，几乎全部来源于胎盘滋养细胞。怀孕4周可检出，8周后含量上升并稳定存在。（7周建立胎儿胎盘循环）。cffDNA片段比较小，长度在75bp和250bp之间。母体外周血中的cffDNA含量在5%到30%之间。孕周越大外周血中胚胎DNA的含量越高。与母亲体重有关。产后2hr之内消失。2022-6-10

31、5022条常染色体23条常染色体20% 胚胎 DNA380%2胎儿 80%母亲染色体非整倍体导致剂量变化2022-6-1051技术和科学的目标技术和科学的目标 that government of the people, by the people, for the people, shall not perish from the earth.by Abraham Lincoln2022-6-1052基因诊断的制高点多基因病： 能否靠基因芯片或微阵列解决？ 靶细胞靶细胞对照细胞对照细胞Cy5红色靶杂交到MicroarrayCy3绿色靶逆转录标记逆转录标记收获收获 RNA Random arr

32、ay of clusters 100um2022-6-10532022-6-10划时代的新技术大规模二代测序NGS(Next Generation Sequencing) 人类基因组计划长达10年、耗资千亿、6国数万科学家投入，仅完成4个人的基因2007年：1人，3天内，3000美元，费用和时间在以每年递减一半的速度下降取代所有一切，40种常见病发表。多基因病时代来了？SOLEXA_illumina 1G Genome Analyzer542022-6-10Instrument without CoversFluidics & electronicsFlow cell & de

33、tectionLaser optics552022-6-10Flowcell in Imaging Location562022-6-10基因诊断和产前基因诊断中的知情同意和伦理学问题知情同意和伦理学问题实验室有认证、国家标准和质量控制实验室有认证、国家标准和质量控制实验人员有许可证实验人员有许可证有标准实验流程有标准实验流程MOPS、质控、质控/质评质评签发临检报告要慎重、留余地签发临检报告要慎重、留余地可靠性和及时性兼备可靠性和及时性兼备57样品的采集与保存对象对象 保存环境保存环境 保存期限保存期限白细胞/皮肤细胞* 低温 20C 1年EBV转化淋巴细胞系* 冻存液氮 无限组织 冰冻80

34、C 3年毛发(带毛囊) 低温 20C 1年口腔脱落细胞 低温 20C 1年DNA 高盐冷藏4C 10年RNA全血(抗冻剂) 低温20/80C 1年/3年蛋白粗提物 低温 70C 半年*白细胞可经白细胞可经EBV转化建立永生细胞株，皮肤成纤维细胞可培养永久保存无限扩增转化建立永生细胞株，皮肤成纤维细胞可培养永久保存无限扩增2022-6-1058还有很重要的，样本库2022-6-10完整有用的样本一定要有专业的数据库：临床和背景资料齐全临床和背景资料齐全有编号、易检索（条形码有编号、易检索（条形码管理）管理）纳入合适的样本库纳入合适的样本库保存条件合格保存条件合格无降解无降解无污染无污染数据库要素

35、：数据库要素：病人一般资料病人一般资料 临床特点临床特点家族资料家族资料样品管理样品管理家系调查网络组家系调查网络组59构成小型样本库的硬件和软件构成小型样本库的硬件和软件每台立式冰箱：1620个耐酸铝架;20个蜡纸or塑料盒/架;99冻存管/盒=2592032400管标本(3.5ml)条形码打印机条形码打印机耐低温标签耐低温标签扫码枪扫码枪2022-6-1060大型标本库的构成与核心区域规划：缓冲区核心：库区监控室样本接收区样本处理区辅助功能区：用品库、办公室、更衣室2022-6-106162是多功能的大型实验室：是多功能的大型实验室：研究研究教学教学临床基因诊断标本库标本库实验中心大楼位于北大医院实验中心大楼位于北大医院门诊南侧门诊南侧,7 层层, 面积面积7000m2Central laboratoryRese