药学分子生物学实验1

1、l实验实验1 质粒质粒DNA的提取的提取l实验实验2 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）扩增质粒）扩增质粒DNAl实验实验3 限制性核酸内切酶酶切质粒限制性核酸内切酶酶切质粒DNA 实验实验4 琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳鉴定实验基本操作实验基本操作 微量高速离心机（样品分离）微量高速离心机（样品分离） 移液器（微量取液）移液器（微量取液） 混匀方式（震荡、轻弹、吹吸）混匀方式（震荡、轻弹、吹吸）微量高速离心机操作微量高速离心机操作 装液（装液（1.5ml 离心管或离心管或0.2ml PCR管）管） 标记标记(记号记号笔笔) 平衡（等体积相同管）平衡（等体积相同管） 放置（放置（对称对称

2、！）！） 离心（时间按钮，转速按钮）离心（时间按钮，转速按钮） 注意：缓慢转动，记录时间注意：缓慢转动，记录时间 停止（转速按钮回零，时间按钮回零，完全停停止（转速按钮回零，时间按钮回零，完全停止后止后轻轻轻轻取出离心管）取出离心管）移液器规范操作移液器规范操作工作原理：工作原理： 含内置活塞，通过含内置活塞，通过弹簧弹簧的伸的伸缩运动，推动空气，实现吸缩运动，推动空气，实现吸液和放液。液和放液。实验结束时将移液器调至最大量程！实验结束时将移液器调至最大量程！移液器规范操作移液器规范操作 第一步第一步:设定移液体积设定移液体积 选取合适移液器（量程范围），调整按钮至所选取合适移液器（量程范围）

3、，调整按钮至所需体积的刻度。需体积的刻度。第一步：第一步：设定移液体积设定移液体积 从大量程调节至小量程，从大量程调节至小量程，精度最佳精度最佳 从小量程调节至大量程，从小量程调节至大量程，最好先调至略大一点，最好先调至略大一点，再返回再返回大体积至小体积大体积至小体积小体积至大体积小体积至大体积旋转刻度调节旋转刻度调节旋钮旋钮 严格的精确调节方法严格的精确调节方法移液器规范操作移液器规范操作 第一步第一步:设定移液体积设定移液体积 第二步第二步:装配移液器吸头装配移液器吸头 垂直插入吸头，左右微微转动，上紧。垂直插入吸头，左右微微转动，上紧。第二步：装配移液器吸头第二步：装配移液器吸头轻取吸

4、头，左右转动轻取吸头，左右转动第三步第三步:吸取液体吸取液体正向吸液正向吸液移液器按钮分移液器按钮分2档：档：I 档：吸液；档：吸液；II 档：档： 放液放液n垂直吸液垂直吸液n吸头尖端需浸入页面吸头尖端需浸入页面3mm以下以下n缓慢吸液缓慢吸液第四步第四步:放液放液 n完全打出，吸头尖靠内壁，排出最后的液滴；完全打出，吸头尖靠内壁，排出最后的液滴；n按钮待液体完全打出后再放松按钮待液体完全打出后再放松血清和粘性液体的吸液和放液血清和粘性液体的吸液和放液速度都要保持缓慢速度都要保持缓慢1.用大量程的移液器移取小体积的液体用大量程的移液器移取小体积的液体2.装配吸头时气密性不好，吸头不匹配装配吸

5、头时气密性不好，吸头不匹配吸液速度和放液速度太快吸液速度和放液速度太快 自我检测漏气：自我检测漏气：吸取液体，垂直静置吸取液体，垂直静置5秒，秒，观察是否有液滴流出；观察是否有液滴流出；规范操作，损坏赔偿！规范操作，损坏赔偿！移液不准确的常见原因：移液不准确的常见原因：废弃物的处理废弃物的处理1.吸头，放置在塑料袋中吸头，放置在塑料袋中1.废液，倒在废液缸中废液，倒在废液缸中1.实验中所有的废弃物集中高压灭菌后再丢弃实验中所有的废弃物集中高压灭菌后再丢弃实验报告实验报告1. 原理原理2. 操作步骤操作步骤3. 实验结果实验结果4. 思考题思考题实验实验1 质粒质粒DNA的提取的提取 碱裂解法碱

6、裂解法质粒（质粒（plasmid） 独立于染色体外，非宿主生长所必需，能进行复独立于染色体外，非宿主生长所必需，能进行复制和遗传的辅助性遗传单位（小型双链环状制和遗传的辅助性遗传单位（小型双链环状DNA）。）。菌体在菌体在NaOH和和SDS溶液中裂解时，溶液中裂解时，DNA（质粒（质粒DNA和染色体和染色体DNA）发生变性（强碱破坏碱基配对）发生变性（强碱破坏碱基配对）加入酸性液中和后，闭环质粒加入酸性液中和后，闭环质粒DNA链能够迅速复性，链能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；染色体呈溶解状态，离心时留在上清中；染色体DNA不能不能复性，沉淀下来。复性，沉淀下来。碱裂解法抽提质粒碱裂

7、解法抽提质粒DNA原理原理利用质粒利用质粒DNA和染色体和染色体DNA在拓扑学上的差异达到分离目在拓扑学上的差异达到分离目的的 1.收集细菌，吸取收集细菌，吸取1ml菌液，菌液，10000rpm/5min，弃上清。，弃上清。2.加入加入100ul 溶液溶液I（EDTA, 葡萄糖、葡萄糖、Tris-HCl），在震荡器，在震荡器上重新悬浮沉淀。上重新悬浮沉淀。3.加入加入200ul 溶液溶液II（NaOH, SDS），盖上盖子，颠倒混匀），盖上盖子，颠倒混匀5min。打在盖子可见拉丝现象。打在盖子可见拉丝现象。4.加入加入150ul 溶液溶液III（醋酸、醋酸钠），盖上盖子，颠倒混（醋酸、醋酸钠）

8、，盖上盖子，颠倒混匀后插冰上冰浴匀后插冰上冰浴5min。可见白色沉淀（基因组。可见白色沉淀（基因组DNA、变性、变性蛋白质蛋白质SDS的混合物）。的混合物）。5.10000rpm/5min，将上清转移至新的，将上清转移至新的EP管中。管中。 以上步骤实现了质粒以上步骤实现了质粒DNA与基因组与基因组DNA的分离的分离操作步骤操作步骤6. 加入500ul酚氯仿混合液，盖上盖子后，摇晃管子混合液体，放置室温5min。7. 10000rpm/5min，将上清转移至新的EP管中。 注意：不要吸取中间的白色沉淀。 以上步骤实现了去除蛋白质的作用。l8. 加加2.5倍体积预冷的无水乙醇倍体积预冷的无水乙醇

9、，混匀，冰浴，混匀，冰浴10min，12000 rpm/5 min；l9.弃上清弃上清，沉淀加沉淀加1ml预冷的预冷的70乙醇乙醇洗涤，洗涤，10000 rpm/5min； 以上步骤沉淀并洗涤质粒以上步骤沉淀并洗涤质粒DNA10.弃尽上清，沉淀于温箱干燥后，加弃尽上清，沉淀于温箱干燥后，加30l TE 溶液溶解，溶液溶解，50水浴水浴10min后后-20 保存。保存。 TE溶液 （TrisHCl，EDTA, Rnase A酶)l实验实验2 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）扩增质）扩增质粒粒DNAPCR扩增重组质粒扩增重组质粒DNA的的GAPDH基因片段基因片段重组质粒重组质粒DNA 目的基

10、因目的基因 GAPDH（205bp）质粒载体质粒载体2692bpAPCR反应体系（反应体系（20 l ）uddH2O 14.0 l 70 lu 10 x 缓冲液（缓冲液（ 10 x b） 2.0 l 10 lu dNTP 2.0 l 10 luprimer 1(P1) 0.4 l 2 luprimer 2(P2) 0.4 l 2 lu Taq 酶酶 0.2 l 1 lu质粒质粒DNA（50100ng/ l) 1.0 l混合体系混合体系19l x5空白对照：以空白对照：以ddH2O替代质粒替代质粒DNA模板模板PCR反应程序反应程序预变性预变性 94 2min变性变性 94 20s退火退火 55

11、 20s延伸延伸 72 20s充分延伸充分延伸 72 5min 30cycles紫外投射分析仪紫外投射分析仪实验实验3 限制性核酸内切酶酶切限制性核酸内切酶酶切质粒质粒DNA简称限制酶，是一类能识别和切割双链简称限制酶，是一类能识别和切割双链DNADNA分子内分子内特特定碱基顺序定碱基顺序的的核酸内切酶核酸内切酶，为原核生物所特有。，为原核生物所特有。型限制酶被称为基因工程的分子剪刀。型限制酶被称为基因工程的分子剪刀。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease, RE）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶作用模式作用模式: :在在特定的位点特定的位点上精确切

12、割双链上精确切割双链DNADNA分子，产生特异末分子，产生特异末端的端的DNADNA片段。片段。 识别序列：识别序列：双链双链DNADNA特异的特异的碱基对碱基对( (一般一般4 4 6 6个个) ) 在识别序列内在识别序列内特特异切割异切割DNADNA磷酸二酯键断裂磷酸二酯键断裂载体载体: : 能将外源能将外源DNADNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。本质为。本质为DNADNA。基本特征：基本特征：q能能自我复制自我复制并具较高的拷贝数。并具较高的拷贝数。q带有带有遗传筛选遗传筛选标记（抗药性、酶基因等）标记（抗药性、酶基因等） 。q有适当的有适当

13、的限制酶切位点限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选，便于外源基因的插入和筛选重组质粒重组质粒DNA 目的基因目的基因 GAPDH (205bp)质粒载体质粒载体2692bp重组重组质粒载体质粒载体2897bpCAGCTGGTCGACPvu II酶切产物：酶切产物：535bp, 2362bp(Pvu II)(Pvu II)Pvu II限制酶切反应体系（限制酶切反应体系（20 l ） ddH2O 10 l 10 x 缓冲液（缓冲液（ 10 x b） 2 l 重组质粒重组质粒DNA 7 l Pvu II 1 l 混匀，混匀，37 水浴水浴 1h加样注意事项：加样注意事项：1. 直接加到液体里面，不

14、要加到管壁上直接加到液体里面，不要加到管壁上2. 加完后保持液体在管底，勿使液体溅起加完后保持液体在管底，勿使液体溅起限制性内切酶反应影响因素：限制性内切酶反应影响因素： DNADNA的纯度和结构的纯度和结构 反应缓冲液的反应缓冲液的pHpH值及离子浓度值及离子浓度 酶解温度和时间酶解温度和时间 限制酶质量限制酶质量 根据特异识别序列切割根据特异识别序列切割DNADNA片段片段 用于基因组计划研究（物理图谱，基因定位，用于基因组计划研究（物理图谱，基因定位，DNADNA同源性分析同源性分析 , DNA, DNA甲基化碱基的识别与切割）甲基化碱基的识别与切割） 限制性片段长度多态性（限制性片段长

15、度多态性（restriction fragment restriction fragment length polymorphism, RFLPlength polymorphism, RFLP）研究，用于法医学）研究，用于法医学个体识别和遗传性疾病的诊断个体识别和遗传性疾病的诊断限制性内切酶用途：限制性内切酶用途：“分子剪刀分子剪刀”二、二、限制性限制性片段片段长度长度多态性多态性分析分析（RFLP restriction frgment length polymorphism ）基因突变导致碱基组成顺序发生改变，会在基基因突变导致碱基组成顺序发生改变，会在基因结构中产生新的因结构中产生新的

16、限制性核酸内切酶位点限制性核酸内切酶位点或使原有或使原有限制性核酸内切酶位点消失。限制性核酸内切酶位点消失。 因此，因此，突变基因突变基因经相应的经相应的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶水水解后，其电泳解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变条带的数量和大小就会发生改变，根，根据这些改变可以判断突变是否存在。即限制性片段据这些改变可以判断突变是否存在。即限制性片段长度多态性技术。长度多态性技术。苯丙酮尿症（苯丙酮尿症（PKU）苯丙氨酸羟化酶PAH活性降低或其辅酶缺乏，导致苯丙氨酸向酪氨酸代谢受阻，尿中苯丙氨酸旁路代谢产物苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸显著增加。我国PKU患病率约为1:10000。约3

17、/4经典型PKU患者的PAH基因发生点突变。PKU产前诊断： 怀孕1620周时抽取羊水，检测羊水中胎儿细胞中是否带有致病基因突变位点。实验实验4 琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳鉴定核酸产物核酸产物琼脂糖：琼脂糖：琼脂糖是从琼脂中提取出来的，由琼脂糖是从琼脂中提取出来的，由D-D-半乳糖半乳糖和和3,6-3,6-脱水脱水-L-L-半乳糖组成的链状多糖分子，半乳糖组成的链状多糖分子，可以形成具有刚性的网孔状凝胶。琼脂糖的可以形成具有刚性的网孔状凝胶。琼脂糖的浓度决定凝胶孔径的大小。浓度决定凝胶孔径的大小。琼脂糖凝胶电泳原理：琼脂糖凝胶电泳原理：DNADNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在电场作分子

18、在碱性缓冲液中带负电荷，在电场作用下向正极泳动。用下向正极泳动。琼脂糖凝胶电泳法分离鉴定琼脂糖凝胶电泳法分离鉴定DNADNA，主要是利用，主要是利用分子筛效应分子筛效应。线性双链。线性双链DNADNA分子迁移率与其分分子迁移率与其分子量的对数值成子量的对数值成反比反比。不同大小和构象的不同大小和构象的DNA DNA 分子在相同的电泳条分子在相同的电泳条件下，通过凝胶的迁移率不同，所以可通过电件下，通过凝胶的迁移率不同，所以可通过电泳使其分离。泳使其分离。123456上样缓冲液上样缓冲液 (Loading Buffer)(Loading Buffer)上样缓冲液组成：上样缓冲液组成：电泳指示剂与

19、蔗糖电泳指示剂与蔗糖( (或甘油或甘油) )组成上样缓冲液组成上样缓冲液电泳指示剂：电泳指示剂：溴酚兰溴酚兰 （紫兰色）（紫兰色）二甲苯青二甲苯青 （兰色）（兰色）上样缓冲液作用：上样缓冲液作用：1 1）使样品呈色，便于加样操作）使样品呈色，便于加样操作2 2）增加样品密度和比重，以确保）增加样品密度和比重，以确保DNADNA样品均匀沉入加样孔内样品均匀沉入加样孔内3 3）在电泳中形成肉眼可见的指示带，可判断）在电泳中形成肉眼可见的指示带，可判断DNADNA电泳的速度和位置电泳的速度和位置荧光染料荧光染料 (SYBR Green I)(SYBR Green I)SYBR SYBR Green

20、IGreen I 荧光染料荧光染料SYBR Green ISYBR Green I嵌入嵌入DNADNA的碱基平面后，本身无的碱基平面后，本身无荧光的荧光的DNADNA在紫外光激发下发出荧光，且荧光强度与在紫外光激发下发出荧光，且荧光强度与DNADNA含量呈正比。含量呈正比。DNA DNA 分子标准物分子标准物 (DNA Marker)(DNA Marker)DL2000DL20001 kb DNA Ladder 1 kb DNA Ladder 100 bp DNA Ladder100 bp DNA Ladder琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳优点优点：q 操作简便操

21、作简便q 电泳速度快电泳速度快q 透明而不吸收紫外线，电泳后易染色和回收透明而不吸收紫外线，电泳后易染色和回收q 琼脂糖结构均匀，以其作为介质进行电泳得到的琼脂糖结构均匀，以其作为介质进行电泳得到的DNADNA条带清晰、分辨率条带清晰、分辨率高、重复性好高、重复性好琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳应用应用：q 核酸分离鉴定核酸分离鉴定 ( (质粒质粒DNADNA分析分析) )q 核酸产物分析核酸产物分析 (PCR(PCR产物分析；产物分析；DNADNA酶切图谱分析酶切图谱分析) )q 核酸纯化回收核酸纯化回收 ( (基因克隆基因克隆) )影响影响DNADNA电泳迁移率的主要因素：电泳迁移率的主要因

22、素：q DNA DNA的分子大小：的分子大小：线性双链线性双链DNADNA分子通过凝分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。胶的速率与其分子量的常用对数成反比。 q DNA DNA的分子构象：的分子构象：相同分子量的闭环相同分子量的闭环 (型型) )，开环，开环 (型型) )和线状和线状(型型) )的的质粒质粒DNADNA，在琼脂糖凝胶中电泳速率不同。迁移率在琼脂糖凝胶中电泳速率不同。迁移率型型型型型。型。q 琼脂糖凝胶的浓度：琼脂糖凝胶的浓度：一定大小的一定大小的DNADNA片段片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率不同。在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率不同。在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不

23、同大小的在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNADNA片段的迁移率也不同。片段的迁移率也不同。q 电场强度和离子强度电场强度和离子强度线性双链线性双链DNADNA分子迁移率与其相对分子量成反比：分子迁移率与其相对分子量成反比： M 1 2 1 2 1 2 M 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 100 bp 200 bp 300 bp 500 bp 1000 bp 100 bp 200 bp 300 bp 500 bp 1000 bp 电电泳泳方方向向正极正极负极负极相同分子量不同构型的相同分子量不同构型的DNADNA分子迁移率不同：分子迁移率不同：三种构型的质粒电泳模式

24、图谱三种构型的质粒电泳模式图谱超螺旋超螺旋 线性线性 开环开环加样孔加样孔开环开环线性线性超螺旋超螺旋0.61.0-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3琼脂糖凝胶浓度和琼脂糖凝胶浓度和DNADNA分子的有效分离范围：分子的有效分离范围：PCR产物电泳图：产物电泳图：300bp引物二聚体引物二聚体目的片段目的片段1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1. DNA marker2-13. PCR扩增产物扩增产物14. 空白对照空白对照质粒质粒DNA电泳图：电泳图：1. DNA Marker2. 质粒质粒DNA样本样本13

25、. 质粒质粒DNA样本样本24. 质粒质粒DNA样本样本3 1 2 3 4 质粒质粒DNA酶切产物电泳图：酶切产物电泳图： 1 2 1. DNA Marker2. 质粒质粒DNA酶切产物酶切产物750bp500bp2000bp琼脂糖凝胶电泳操作步骤：琼脂糖凝胶电泳操作步骤：样品：样品：PCRPCR产物产物 10 10 l l加加上样缓冲液上样缓冲液2 2 l l，加，加Sybr Green ISybr Green I (SG)(SG) 2 2 l l，混匀，混匀取取10 10 l l加入加样孔中加入加样孔中 ( (记录样品次序记录样品次序) )110V110V稳压，电泳约至凝胶稳压，电泳约至凝

26、胶2/32/3处处紫外灯下观察结果紫外灯下观察结果( (与与DNA MarkerDNA Marker比较比较) )记录并画出示意图记录并画出示意图注意：注意：加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防减少移液器的抖动。加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外造成邻孔之间相互污染。止将样品溢出孔外造成邻孔之间相互污染。琼脂糖凝胶电泳操作步骤琼脂糖凝胶电泳操作步骤l样品：样品：PCR产物产物 (混匀后吸取）混

27、匀后吸取）8l；l加加上样缓冲液上样缓冲液 1l，加，加Sybrgreen 1l ，混匀（，混匀（Marker 5l只加只加Sybrgreen 1l ）；）；l加入加样孔；加入加样孔；l100V稳压，电泳至凝胶稳压，电泳至凝胶2/3处；处； l紫外灯下观察结果（样品与紫外灯下观察结果（样品与DNA Marker比较）；比较）；l记录并画出示意图。记录并画出示意图。l DNA分离、纯化、鉴定的常用方法；分离、纯化、鉴定的常用方法；l 电荷效应；电荷效应；分子筛效应分子筛效应；l 分离分离分子量分子量/构型（构象）不同构型（构象）不同的的DNA分子分子琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳-+琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳样品样品加上样缓冲液加上样缓冲液(示踪指示剂示踪指示剂) ，加，加SYBR green I （荧光染料荧光染料），混匀；），混匀； 上样缓冲液包含二甲苯青（相应于上样缓冲液包含二甲苯青（相应于2KbpDNA）和）和溴酚蓝（相应于溴酚蓝（相应于20bpDNA）两种染料）两种染料荧光染色原理荧光染色原理l核酸的荧光染料如溴化乙锭（核酸的荧光染料如溴化乙锭（EB)、SYBR Green I等嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸等嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在