基因工程载体

1、载体：载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的的DNA大分子称之为载体（大分子称之为载体（vector）。）。 （1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达；子和启动子，使插入基因复制和表达；（2）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源这样可将多个外源DNA片段插入其中；片段插入其中；（3）具有容易检测的筛选标记；）具有容易检测的筛选标记；（4）载体）载体DNA的分子量适当，可容纳较大

2、的外源的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；（5）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。代而不易丢失。 克隆载体（克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克）：主要是对目的基因克隆，建立隆，建立DNA文库和文库和cDNA文库，其上有复制子即可；文库，其上有复制子即可；表达载体（表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，主细胞中表达的一类载体。这类载体既有

3、复制子，更要有强启动子；更要有强启动子；穿梭载体（穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。 细菌质粒细菌质粒 (plasmid) 载体是基因工程载体是基因工程 中最常中最常用的载体用的载体, 它必须包括三种组成部分：复制必须它必须包括三种组成部分：复制必须区，选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位区，选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点，点（克隆位点，MCS). 质粒质粒DNA分子具有三种构型：分子具有三种构型： Closed circle DNA, ccDN

4、A; supercoil; SC构型构型 Open circle DNA, OC构型构型; Liner DNA, IDNA; L构型构型.l1. 严紧型和松驰型质粒严紧型和松驰型质粒l严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一般只有般只有13个个松驰型质粒：其拷贝数较多，一般松驰型质粒：其拷贝数较多，一般2060个，多个，多的可达的可达200300个个 3. 质粒的不相容性和不亲和群质粒的不相容性和不亲和群 转移型，结合型（转移型，结合型（conjugative plasmid）是指一些质粒在不）是指一些质粒在不同的菌株中可以相互转移。同的菌株中可以相互转

5、移。 非转移型质粒非转移型质粒(non-conjugative plasmid)则只能在一种寄主则只能在一种寄主中生存中生存 质粒的不相容性：一般地，不同质粒不能共处在一个细质粒的不相容性：一般地，不同质粒不能共处在一个细胞中，这种特性称质粒的不相容性，当它们处在一起时，胞中，这种特性称质粒的不相容性，当它们处在一起时，便有生存竞争，结果一种质粒繁殖，另一种逐渐被排斥，便有生存竞争，结果一种质粒繁殖，另一种逐渐被排斥，数目变少。数目变少。 不亲和群：彼此不相容的质粒组成一个不亲合群。不亲和群：彼此不相容的质粒组成一个不亲合群。 1、人工组建的质粒人工组建的质粒 人工组建的质粒的第一个字母是质粒

6、英文名字人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的第一个字符）的第一个字符p，用小写。，用小写。p后有后有2个字母是大个字母是大写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。例：例：pXYp109；pSC101等等 天然载体质粒的第一个字母大写，且质粒符号用括号天然载体质粒的第一个字母大写，且质粒符号用括号括起来。括起来。如（如（C01E1）。农杆菌质粒用）。农杆菌质粒用p加加Ti（Tumer inducing）或）或At（Agrobacterium tumefacions）表示，如）表示，如pTiC58。2 2、天然

7、载体质粒、天然载体质粒1. pSC101 图（1）组成）组成它由三部分组成：它由三部分组成：来自来自pSCl01的四环素的四环素抗性基因抗性基因Tetr来自来自ColEl的衍生物的衍生物pMBl的松弛复制起点的松弛复制起点ori来自来自RSF2124的氨苄的氨苄青霉素抗性基因青霉素抗性基因Ampr。 （3）重组克隆的重组克隆的 “插入失活插入失活”筛选方法筛选方法 具有多个单一的限制性内切酶位点。具有多个单一的限制性内切酶位点。Tetr中有中有BamH1切点（切点（GGATCC）和）和Sal切点（切点（GAATTC），），Ampr中有中有Pst切点（切点（CTGCAG）。 利用利用ColEl的

8、复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯霉素使质粒的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯霉素使质粒拷贝数进一步扩增。拷贝数进一步扩增。pBR322插入在插入在Tetr中，基因型为中，基因型为Tets 、Ampr在含有氨在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在在含有四环素培养基上不生长；卞青霉素培养基上可生长，在在含有四环素培养基上不生长；pBR322插入在插入在Ampr中，基因型为中，基因型为Tetr 、Amps、在含在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在在含有四环素培养基可不生长；有氨卞青霉素培养基上不生长，在在含有四环素培养基可不生长； 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。而在两种抗生素培

9、养基上都生长的是非重组型。这种在一个这种在一个基因位点中插入外源基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活插入失活。 Amp rTet rTet rAmp sPstI. . . .涂布有涂布有Tet的培养基的培养基涂布有涂布有Amp的培养基的培养基. . .重组体的筛选重组体的筛选外源基因的插入：外源基因的插入：.（1）特点）特点具有更小的分子具有更小的分子量（量（2686bp）和）和更高的拷贝数。更高的拷贝数。具有多克隆位点具有多克隆位点可通过插入失活法进行筛选可通过插入失活法进行筛选含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的含有一个来自于大

10、肠杆菌的经过加工的LacZ基因基因（LacZ），它编码），它编码-半乳糖苷酶氨基端半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸个氨基酸 ，可以和可以和-半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补，半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补，即即互补互补 ，恢复分解乳糖的能力。，恢复分解乳糖的能力。X-gal也是也是-半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无-半乳糖苷酶时，半乳糖苷酶时，X-gal不被分解，菌落呈白色。不被分解，菌落呈白色。 当外源基因插入到当外源基因插入到pUC质质粒的粒的LacZ基因内部，则

11、基因内部，则LacZLacZ基因受到破坏，便不能基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的再和缺陷型受体菌中生成有活性的-半乳糖苷酶，因此，半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。菌落呈白色。 反之，非重组体为蓝色菌落。反之，非重组体为蓝色菌落。含含Ampr抗性基因，可通过插入失活和颜色反应进行双重筛选。抗性基因，可通过插入失活和颜色反应进行双重筛选。lacZlacZN端端 C端端缺陷型大肠杆菌缺陷型大肠杆菌完整的完整的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶（四）大肠杆菌中的表达载体（四）大肠杆菌中的表达载体表达载体应含有：表达载体应含有：（1）强启动子）强启动子（2）在启动子下游区和）在启动子下游区和ATG上

12、游区有一个好的上游区有一个好的SD序列。序列。（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。（一）、（一）、噬菌体载体噬菌体载体 1、噬菌体载体的特征噬菌体载体的特征 噬菌体颗粒中噬菌体颗粒中DNA为线状双链为线状双链DNA分子，全长分子，全长48502bp，两端各有一段长度为两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链（粘端），称个核苷酸的互补单链（粘端），称为为cos位点。位点。噬菌体有噬菌体有6161个基因，其中有个基因，其中有1/31/3的区域是其的区域是其

13、裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中插入外源插入外源DNADNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是，并不影响噬菌体的增殖，这就是噬菌体噬菌体可作为基因载体的依据可作为基因载体的依据 。 GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACG环化作用环化作用噬菌体的改造噬菌体的改造 基因组太大（基因组太大（49kb）；）； 酶切点太多，它有酶切点太多，它有5个个BamH1位点（位点（GGATCC），），6个个Bg位点位点（AGATCT），），5个个EcoR位点（位点（GAATTC）。）。 野生型只能接纳一定长度的野生型只能接纳一定长度

14、的DNA。若相当于。若相当于噬菌体的噬菌体的75-105%，那么只能接纳那么只能接纳49kb5%=2.45kb的的DNA。 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）；或更大）； 去处太多的酶位点，每种酶只留去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；个切口； 增加标记基因（增加标记基因（remarke gene）。）。(4)(4) 引入无义突变引入无义突变噬菌体的缺陷：噬菌体的缺陷：（1）插入型载体）插入型载体 只有只有12种限制性核酸内切酶的单一切割位点种限制性核酸内切酶的单一切割位点 免疫功能失活免疫功能失活大肠杆菌大肠杆菌-

15、半乳糖苷酶失活半乳糖苷酶失活 （2）替换型载体替换型载体 在其中央部位有一个可以被外源插入的在其中央部位有一个可以被外源插入的DNA分子取代的分子取代的DNA片段的克隆载体片段的克隆载体 。这是由于构建此载体时，安排。这是由于构建此载体时，安排在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，因此，当外源因此，当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的插入时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉，从而有效提高了克隆外源片段便会被置换掉，从而有效提高了克隆外源DNA片段片段的能力。的能力。 M13噬菌体属丝状噬菌体，其基因组为闭合环状正链噬菌体属丝状

16、噬菌体，其基因组为闭合环状正链ssDNA，6407bp，其中，其中90%的的DNA都编码蛋白质，有都编码蛋白质，有10个基因，有个基因，有两个较长的间隔区，是外源基因插入的部位。两个较长的间隔区，是外源基因插入的部位。 M13噬菌体产生单双链噬菌体产生单双链DNA的机制。的机制。1、以（、以（+）链）链DNA为摸板，为摸板，合成互补（）链，该双链称复制型合成互补（）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。）。2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。个拷贝。3 3、单链特异的、单链特异的DNADNA结合蛋白结合在（结合蛋白结

17、合在（+ +）链上，从而阻断了其互补链，）链上，从而阻断了其互补链，即（）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（即（）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+ +）链）链DNA DNA 。4 4、游离出来的（、游离出来的（+ +）链）链DNADNA先与基因先与基因V V的编码产物形成特异的的编码产物形成特异的DNA-DNA-蛋白蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V V的蛋白质从（的蛋白质从（+ +）DNADNA链链上脱落下来，余下的上脱落下来，余下的M13M13（+ +）链）链DNADNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜则是从其感染的寄主细胞的细胞膜

18、溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。 +- -+- -+- -+- -+- -+- -单链结合蛋白单链结合蛋白RF型型DNA复制约复制约200copy+以以- -链链DNA为模为模板合成板合成+链链DNA1、构建、构建由质粒和由质粒和噬菌体的粘性末端构建而成的。借用噬菌体的粘性末端构建而成的。借用cos-（粘性（粘性尾巴）作字头，质粒的尾巴）作字头，质粒的-mid作字尾，故称作字尾，故称Cosmid，也叫粘，也叫粘粒载体。粒载体。 2、特点、特点（1） 有有噬菌体的高效感染能力。噬菌体的高效感染能力。 有质粒的高效复制特性。有质粒的高效复制特性。

19、 有更广泛寄主。有更广泛寄主。 有较大的容量。有较大的容量。主要用途：用于主要用途：用于DNA 序列分析序列分析含有含有E.coli质粒的复制起始序列，这样在外源基因转到酵质粒的复制起始序列，这样在外源基因转到酵母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。含有酵母的筛选标记，这样当重组质粒转入相应的酵母细含有酵母的筛选标记，这样当重组质粒转入相应的酵母细胞后，可用来筛选重组体。胞后，可用来筛选重组体。具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。共同的特点：共同的特点：多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链多数酵母中含有一种能独立复制的环状

20、双链DNA，称为，称为2质粒，长约质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主，有单一的复制起始点和一个自主复制功能区域（复制功能区域（ARS片段）。片段）。 根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、附加型和稳定型等类型。附加型和稳定型等类型。 复制复制型：是酵母型：是酵母DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的，片段插入到大肠杆菌质粒中构成的，插入片段含有酵母的筛选标记插入片段含有酵母的筛选标记ura3和和2uDNA片段，一般以片段，一般以低拷贝数维持在酵母染色体之外。复制型载体对酶母的转低拷贝数维持在酵母染色体之外。复制型载体对

21、酶母的转化率极高（化率极高（102103转化子转化子/g DNA），但是转化子不稳），但是转化子不稳定，容易丢失。定，容易丢失。 附加型：附加型：是在是在pBR322中插入酵母筛选标记和中插入酵母筛选标记和2uDNA的的ARS序列构建成的。这种质粒以附加体的形式存在于真核序列构建成的。这种质粒以附加体的形式存在于真核细胞中。附加型型载体对酵母具有很高的转化活性细胞中。附加型型载体对酵母具有很高的转化活性（102103转化子转化子/g DNA），且与复制型相比，稳定性），且与复制型相比，稳定性高，拷贝数也较高（高，拷贝数也较高（25100分子分子/ 细胞）。细胞）。 稳定型：稳定型：在附加型载体

22、中再插入酵母着丝粒的一个在附加型载体中再插入酵母着丝粒的一个DNA片段（片段（CEN）。）。 一、根癌农杆菌及一、根癌农杆菌及Ti质粒质粒 （一）、根癌农杆菌与冠瘿瘤（一）、根癌农杆菌与冠瘿瘤 根癌农杆菌属根瘤菌科农杆菌属，通过伤口可感染双子叶根癌农杆菌属根瘤菌科农杆菌属，通过伤口可感染双子叶植物，并在创伤部位使组织恶性增生而形成植物肿瘤，叫植物，并在创伤部位使组织恶性增生而形成植物肿瘤，叫冠瘿瘤（冠瘿瘤（crown galltumor）。）。 冠瘿碱冠瘿碱类植物激素类植物激素 章鱼碱章鱼碱胭脂碱胭脂碱农杆碱农杆碱1、T-DNA区区Ti质粒是农杆菌非染色体的环状双链质粒是农杆菌非染色体的环状双

23、链DNA分子，分子，分子量为分子量为90106150106道尔顿，有道尔顿，有16240kb。 致病菌株致病菌株37培养培养治愈菌株治愈菌株 （Ti质粒被消除）质粒被消除）治愈菌株治愈菌株 与致病菌株接合与致病菌株接合致病菌株（重新获得致病菌株（重新获得Ti质粒）质粒）胭脂碱型质粒胭脂碱型质粒T区大小约区大小约23kb，单一序列插入植物核，单一序列插入植物核DNA。 章鱼碱型章鱼碱型左区左区(TL-DNA)：长约长约13kb，通常为单拷贝，通常为单拷贝，有诱发和维持肿瘤的作用。有诱发和维持肿瘤的作用。右区右区(TR-DNA)：长约长约7kb，多拷贝的，多拷贝的 含有含有参与冠瘿碱生物合成的蛋白

24、酶的编码基因。参与冠瘿碱生物合成的蛋白酶的编码基因。图章鱼碱章鱼碱pTiAch5和胭脂碱和胭脂碱pTiC58质粒的遗传图质粒的遗传图共同区：共同区：T区有控制肿瘤形态和编码冠瘿碱合成酶基因，区有控制肿瘤形态和编码冠瘿碱合成酶基因，实际上实际上shi基因与生长素合成有关。基因与生长素合成有关。roi基因与细胞分裂基因与细胞分裂素合成有关，素合成有关，Ocs是章鱼碱合成酶基因，是章鱼碱合成酶基因，Agr是编码农杆是编码农杆碱合成酶基因，章鱼碱型与胭脂碱型的碱合成酶基因，章鱼碱型与胭脂碱型的T区中上述基因区中上述基因分布不完全一致，但分布不完全一致，但90是相同的称共同区。是相同的称共同区。3个同源

25、区段，含有个同源区段，含有6个基因位点，是冠瘿瘤形成个基因位点，是冠瘿瘤形成所必需的，统称所必需的，统称“致癌基因致癌基因”(oncogene，onc)。 非同源序列则编码冠瘿碱合成酶，在胭脂碱非同源序列则编码冠瘿碱合成酶，在胭脂碱型中叫型中叫Nos，章鱼碱型酶叫，章鱼碱型酶叫Ocs。 共同区共同区已知已知T-DNA的两侧是被一对保守的的两侧是被一对保守的25bp的重复序列包围的重复序列包围着，而且在一系列不同的植物肿瘤着，而且在一系列不同的植物肿瘤DNA中发现，中发现，T-DNA的两边端点是位于这种同向重复序列的当中或附近，这的两边端点是位于这种同向重复序列的当中或附近，这种同向重复序列实际

26、上就是种同向重复序列实际上就是T-DNA的边缘区。的边缘区。右侧边缘区又叫右侧边缘区又叫RB序列，左侧边缘区又叫序列，左侧边缘区又叫LB序列。序列。2、毒性毒性Vir 区，区，VirA、B、D和和G为致瘤性，它们的突变型为非致病性。为致瘤性，它们的突变型为非致病性。VirA、C、D编码专一核酸内切酶蛋白，与编码专一核酸内切酶蛋白，与VirB共同共同作用，与作用，与T-DNA迁移直接有关。迁移直接有关。VirC部分决定寄主范围部分决定寄主范围VirE与菌体感染过程有关与菌体感染过程有关Vir区大约区大约35kb，包含，包含6个互补群，个互补群，A、B、C、D、E、G。 3、代谢区代谢区Tra，T

27、-DNA转移功能；转移功能；Agr，农杆碱代谢；，农杆碱代谢；Inc，不同类型质粒代谢相容性；，不同类型质粒代谢相容性；Occ和和Noc，章鱼碱和胭脂碱分解代谢。，章鱼碱和胭脂碱分解代谢。1、侵染过程、侵染过程2、T-DNA的转移的转移（1）创伤植物细胞释放出可激活）创伤植物细胞释放出可激活Ti质粒质粒Vir基因进行转录的基因进行转录的蛋白因子；蛋白因子；（2）VirA和和VirD蛋白因子进一步激活其它的蛋白因子进一步激活其它的Vir基因进行表达；基因进行表达；（3）先在）先在Ti质粒右侧边缘区产生出头一个单链缺口；质粒右侧边缘区产生出头一个单链缺口；（4）接着在）接着在Ti质粒左侧边缘区产生

28、出另一个单链缺口，结果质粒左侧边缘区产生出另一个单链缺口，结果释放出的单链释放出的单链T-DNA分子便定向地转移到植物细胞，并随机分子便定向地转移到植物细胞，并随机整合到寄主染色体基因组上；整合到寄主染色体基因组上；（5）Ti质粒中移走的单链质粒中移走的单链T-DNA区，通过区，通过DNA复制得到修复。复制得到修复。1、可行性、可行性2、存在缺陷、存在缺陷（1）转化植物细胞很难形成完整植株。）转化植物细胞很难形成完整植株。（2）质粒上分布着多个酶切位点，而不是单一切点，酶切）质粒上分布着多个酶切位点，而不是单一切点，酶切后不易成环，给插入目的基因带来困难。后不易成环，给插入目的基因带来困难。（

29、3）Ti质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增，可农质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增，可农杆菌对杆菌对Ti的转化率太低，只有的转化率太低，只有109107左右左右 。（1 1）将细菌转座子）将细菌转座子Tn7插入胭脂碱合成酶基因（插入胭脂碱合成酶基因（Nos）位）位置上，该置上，该Ti质粒仍能实现质粒仍能实现T-DNA转移。转移。 （2 2）用）用Cat与与NosNos和和OcsOcs基因启动子拼接后，重组进入基因启动子拼接后，重组进入Ti质粒，质粒，Ti质粒感染植物，植物细胞中检测到了质粒感染植物，植物细胞中检测到了Cat基因的酶的存在。基因的酶的存在。 1、去除致瘤基因去除致瘤基因Onc 由

30、于影响植株再生的直接原因是由于影响植株再生的直接原因是T-DNA中的中的Onc基因的致瘤基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成为无毒的质粒，记为作用，因此，切除其致瘤基因，使成为无毒的质粒，记为Onc，这个过程叫，这个过程叫“卸甲卸甲”、 “缴械缴械”或或“解除武装解除武装”，构建的构建的Onc载体叫载体叫“卸甲载体卸甲载体” 。例：例：pGV38502、共整合质粒共整合质粒 （1 1）首先构建中间载体，如将大肠杆菌）首先构建中间载体，如将大肠杆菌pBR322质粒带质粒带上一段与上一段与Ti质粒质粒T区同源的一个片段，它在大肠杆菌和农区同源的一个片段，它在大肠杆菌和农杆菌中均能复制；杆菌中

31、均能复制；（2 2）然后将目的基因插入该片段的适当位置，这样使目）然后将目的基因插入该片段的适当位置，这样使目的基因两端带上了与的基因两端带上了与Ti质粒质粒T-DNA同源的同源的DNA序列；序列；（3 3）然后再将该质粒通过转化或接合引入含有）然后再将该质粒通过转化或接合引入含有Ti质粒的质粒的农杆菌中。农杆菌中。（4 4）引入的衍生质粒和原细胞中）引入的衍生质粒和原细胞中Ti质粒具同源性，因质粒具同源性，因而可产生无性配对重组，通过交换，可将目的基因转而可产生无性配对重组，通过交换，可将目的基因转到到Ti质粒上，使之产生真正的具有外源基因的质粒上，使之产生真正的具有外源基因的Ti质粒，质粒

32、，称共整合质粒。称共整合质粒。 3、双元载体双元载体 “双元载体双元载体” ，也称反式载体，是指由两个分别含也称反式载体，是指由两个分别含T-DNA和和Vir相容性相容性Ti质粒构成的双质粒系统。质粒构成的双质粒系统。 含有为含有为T-DNA转移所必须的转移所必须的Vir区的质粒，区的质粒，另一个则是含有另一个则是含有T-DNA区段的寄主范围广泛的区段的寄主范围广泛的DNA转移载转移载体质粒，后一种质粒较小，可在大肠杆菌中复制，因而易体质粒，后一种质粒较小，可在大肠杆菌中复制，因而易操作，可用来插入外源基因。操作，可用来插入外源基因。4、载体盒载体盒 所谓所谓“载体盒载体盒”(Vector c

33、assette)是将植物的标志基因、多是将植物的标志基因、多插入位点、细菌标志基因和质粒的复制启动子位点等集于插入位点、细菌标志基因和质粒的复制启动子位点等集于一身的质粒系统，象一个集装箱似的集合在一起。一身的质粒系统，象一个集装箱似的集合在一起。 三、三、CaMV(花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒)载体系统载体系统 Ri质粒其结构和功能与质粒其结构和功能与Ti十分相似。十分相似。与与Ti质粒相比的优点：可以构建完整的质粒相比的优点：可以构建完整的Onc+载体。载体。花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒(caulimovirus，简称，简称CaMV)实际上是一个实际上是一个病毒群，已知有病毒群，已知有12

34、个种，每个种的寄主范围都很窄，不感个种，每个种的寄主范围都很窄，不感染豆类和单子叶植株，它的主要寄主是芸苔属。染豆类和单子叶植株，它的主要寄主是芸苔属。 CaMV DNA有两个特别之点，一是在专一位点有不连续性，有两个特别之点，一是在专一位点有不连续性，DNA链上有一处到三处不连续；另一点是在电镜下观察到链上有一处到三处不连续；另一点是在电镜下观察到DNA大部分有盘绕结构，看上去似超螺旋。大部分有盘绕结构，看上去似超螺旋。2 2、混合载体系统、混合载体系统 缺陷性缺陷性CaMV + + 辅助病毒分子辅助病毒分子 将将CaMV DNA克隆到了克隆到了Ti质粒上，通过农杆菌导入植物细质粒上，通过农

35、杆菌导入植物细胞，可产生典型的病毒感染症状。胞，可产生典型的病毒感染症状。 3、CaMV35S启动子融合基因载体系统启动子融合基因载体系统 SalI Kmr SalISalITi质粒质粒T- DNA区区SalI Kmr SalI混合载体构建过程混合载体构建过程SalISalISalI（一）、脂质体结构与性质（一）、脂质体结构与性质 脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂双分子层围成的囊状结脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂双分子层围成的囊状结构，这种结构是一种分子排列有序的近晶型液晶。构，这种结构是一种分子排列有序的近晶型液晶。脂质体的主要成分是磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸，脂质体的主要成分是磷脂

36、，如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺等。磷脂酰乙醇胺等。 图制备方法：制备方法：有超声波法、机械振荡法、透析法、融合法以有超声波法、机械振荡法、透析法、融合法以及逆向蒸发法等。及逆向蒸发法等。 脂质体作为载体的机理与细菌球质体的作用是相似的，它脂质体作为载体的机理与细菌球质体的作用是相似的，它能将能将DNA包埋在里边，在包埋在里边，在PEG诱导下，通过细胞的吞噬或诱导下，通过细胞的吞噬或融合作用将内含物转入受体细胞，最终与受体核融合作用将内含物转入受体细胞，最终与受体核DNA结合。结合。脂质体与细胞的相互作用主要有以下几种形式：脂质体与细胞的相互作用主要有以下几种形式： 1. 内吞作用内

37、吞作用2. 融合作用融合作用3. 交换作用交换作用 优点：使包装在里边的物质（质粒或优点：使包装在里边的物质（质粒或DNA）能避开核酸）能避开核酸酶的降解，对受体无毒性，易被吸收，运送率高，转化酶的降解，对受体无毒性，易被吸收，运送率高，转化率高。更重要的是脂质体制备比常用的质粒载体要容易率高。更重要的是脂质体制备比常用的质粒载体要容易得多，价格低廉，技术操作也简单得多。得多，价格低廉，技术操作也简单得多。 一、一、SV40 整合型：整合型：即外源基因通过这种病毒载体整合到宿主细胞的染即外源基因通过这种病毒载体整合到宿主细胞的染色体上，随着宿主细胞基因组的复制而扩增。色体上，随着宿主细胞基因组的复制而扩增。 游离型：或称病毒颗粒型，携带有外源基因的这类载体