实验五 酶联免疫吸附试验

1、1微生物学实验微生物学实验实验五实验五酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验 ELISA 病原生物学免疫学实验室病原生物学免疫学实验室2 一、实验目的一、实验目的1 1、了解、了解ELISA-HBsAgELISA-HBsAg的检测原理的检测原理2 2、掌握酶联免疫吸附试验的操作方法、掌握酶联免疫吸附试验的操作方法3二、实验标本及器材二、实验标本及器材乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒4三、实验原理三、实验原理o乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒采用双抗体夹心乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒采用双抗体夹心法检测法检测HBsAg，采用抗，采用抗-HBs包被板条，用包被板条，用HRP标

2、记的抗标记的抗-HBs为酶标记物，以四甲基联苯胺为酶标记物，以四甲基联苯胺（TMB）和过氧化物为底物。当标本中存在）和过氧化物为底物。当标本中存在HBsAg时，该时，该HBsAg与包被抗与包被抗-HBs结合并与抗结合并与抗-HBs-HRP结合形成抗结合形成抗-HBs- HBsAg-抗抗-HBs-HRP复合物，加入复合物，加入TMB底物产生显色反应。底物产生显色反应。在实验结束时，有颜色变化的提示有在实验结束时，有颜色变化的提示有HBsAg存在，存在，无颜色或颜色变化微弱的则提示不存在无颜色或颜色变化微弱的则提示不存在HBsAg。5三、实验原理三、实验原理6三、实验原理三、实验原理7四、实验步骤

3、四、实验步骤o1、实验准备：从冷藏环境中取出试剂盒，、实验准备：从冷藏环境中取出试剂盒，在室温下平衡在室温下平衡30分钟，同时将浓缩洗涤液分钟，同时将浓缩洗涤液做做1比比20稀释。稀释。o2、加待测标本：设阴性、阳性对照各一孔，、加待测标本：设阴性、阳性对照各一孔，分别加入阴性、阳性对照分别加入阴性、阳性对照0.1毫升，空白对毫升，空白对照一孔，其余各孔加入待测标本照一孔，其余各孔加入待测标本0.1毫升。毫升。o3、加酶结合物：每孔、加酶结合物：每孔0.1毫升，空白对照毫升，空白对照孔不加，充分混匀，孔不加，充分混匀，37摄氏度温育摄氏度温育30分钟。分钟。8四、实验步骤四、实验步骤o4、洗板

4、：弃去反应孔板内液体，在吸水纸、洗板：弃去反应孔板内液体，在吸水纸上拍干，用洗涤液注满每孔，静置上拍干，用洗涤液注满每孔，静置5至至10秒，秒，弃去孔内洗涤液，拍干，如此反复弃去孔内洗涤液，拍干，如此反复5次，拍次，拍干。干。o5、加显色剂：先加显色剂、加显色剂：先加显色剂A，每孔，每孔0.05毫毫升，再加显色剂升，再加显色剂B，每孔，每孔0.05毫升，充分毫升，充分混匀，置混匀，置37摄氏度温育摄氏度温育15分钟。分钟。o6、终止反应：每孔加入终止液、终止反应：每孔加入终止液0.05毫升，毫升，混匀。混匀。9五、实验结果五、实验结果10六、注意事项六、注意事项o1、洗板至关重要，应避免洗涤液过量，又、洗板至关重要，应避免洗涤液过量，又能充满反应微孔，洗板次数不应少于能充满反应微孔，洗板次数不应少于5次。次。o2、如任何试剂接触皮肤和眼睛，应用大量、如任何试剂接触皮肤和眼睛，