E-玫瑰花结实验

1、实验内容实验内容 E-花环形成试验（同学操作）花环形成试验（同学操作） 一、外周血单个核细胞的分离一、外周血单个核细胞的分离 细胞来源：人外周血细胞来源：人外周血 分离的方法：聚蔗糖泛影葡胺分离的方法：聚蔗糖泛影葡胺密度梯度离心法密度梯度离心法（2）离心后小心取出，可见管中的液体分以下三层，）离心后小心取出，可见管中的液体分以下三层，用尖头滴管吸出上下两层液体之间呈灰白色的单用尖头滴管吸出上下两层液体之间呈灰白色的单个核细胞层，移入另一试管中，用适量（约个核细胞层，移入另一试管中，用适量（约10ml）1640细胞培养液混匀。细胞培养液混匀。 淋巴细胞分离液血浆、血小板、Hanks液红细胞单个核

2、细胞多形核白细胞1、人外周血单个核细胞（、人外周血单个核细胞（PMBC）的分离）的分离 （1） 抗凝血抗凝血3ml + 1640细胞培养液细胞培养液 3ml （倾倒（倾倒法混匀），用吸管吸取上述稀释后的细胞悬液法混匀），用吸管吸取上述稀释后的细胞悬液（6ml），）， 小心小心叠加叠加于淋巴细胞分离液（于淋巴细胞分离液（3ml）上。）上。注意保持两者分界面清晰！注意保持两者分界面清晰！ 平衡后即离心（平衡后即离心（2500rpm，20min）实验流程实验流程肝素抗凝血及肝素抗凝血及Hanks液液淋巴细胞分离液淋巴细胞分离液（2）离心后小心取出，可见管中的液体分以下三层，）离心后小心取出，可见管中

3、的液体分以下三层，用尖头滴管吸出上下两层液体之间呈灰白色的单用尖头滴管吸出上下两层液体之间呈灰白色的单个核细胞层，移入另一试管中，用适量（约个核细胞层，移入另一试管中，用适量（约5ml）1640液混匀，洗涤一次。液混匀，洗涤一次。 淋巴细胞分离液血浆、血小板、Hanks液红细胞单个核细胞多形核白细胞（3）将上述单个核细胞混悬液离心（）将上述单个核细胞混悬液离心（2000rpm，10min），弃上清，加入），弃上清，加入定量定量（约（约0.8ml，注意，注意:加入量一定要准确加入量一定要准确!）Hanks液混匀配成液混匀配成1ml的液的液体。体。 2 淋巴细胞计数淋巴细胞计数 方法方法 PBMC

4、悬液0.1ml+0.9ml 0.5-1%冰醋酸，混匀后滴加1滴 液体于细胞计数板上，在低倍镜下计数四大格单个核细胞总和。 计数原则计数原则 a. 偶见两个以上组成细胞团按单个细胞计算 b压线细胞计左不计右，计上不计下 计数结果：计数结果： （四大格细胞数和）25000即待测细胞悬液的浓度（单位ml) n注意事项：注意事项：ni. 注入细胞板上的细胞悬液量要适量，不理想者重试.nii. 计数后计数板立即浸入水，以防细胞悬液变干；低倍镜镜头回收 E-花结形成试验原理原理 人外周血人外周血T T淋巴细胞上能与绵羊红细胞结合淋巴细胞上能与绵羊红细胞结合的受体，称为的受体，称为E E受体，即受体，即CD

5、2CD2分子或分子或LFA-2 LFA-2 （淋巴细（淋巴细胞功能相关抗原胞功能相关抗原-2-2） ；在一定的试验条件下，绵羊；在一定的试验条件下，绵羊红细胞能与该受体结合形成以红细胞能与该受体结合形成以T T细胞为中心，四周绕细胞为中心，四周绕以绵羊红细胞的玫瑰花团，故称以绵羊红细胞的玫瑰花团，故称E E花环形成试验。花环形成试验。花结花结分类：花结分类：Ea-RFC(效应效应T细胞细胞)：正常值为：正常值为1535%。E-RFC(总和总和)：正常值为：正常值为6080%。意义：意义： E-受体为受体为T细胞所特有，是鉴定细胞所特有，是鉴定T细胞的重要标志之细胞的重要标志之一，还用于一，还用

6、于T细胞的分离。细胞的分离。 用于检测患者外周血中用于检测患者外周血中T细胞的比例及数目，间接反细胞的比例及数目，间接反映患者细胞免疫功能。映患者细胞免疫功能。3 E-花环形成花环形成 1.将计数后的细胞悬液用将计数后的细胞悬液用Hanks液配成液配成1106 /ml，将剩下的约，将剩下的约0.9ml细胞悬液，离心细胞悬液，离心（2000rpm，10min）后弃上清，留约）后弃上清，留约0.1ml压积细胞。压积细胞。2.用用0.1ml预先经预先经SRBC吸收的吸收的10%小牛血清将小牛血清将上述压积细胞搓捻重新悬浮，而后加入上述压积细胞搓捻重新悬浮，而后加入0.2ml 1%SRBC，轻轻摇匀，

7、轻轻摇匀，37预温预温5min后离心（后离心（500-1000rpm，5min），），4冰箱冰箱中放置中放置1.5h。 4 固定、染色、镜检固定、染色、镜检 固定：取出孵育后的细胞，吸弃部分上固定：取出孵育后的细胞，吸弃部分上清，留约清，留约0.1-0.2ml，轻轻旋转、搓捻使，轻轻旋转、搓捻使细胞悬浮，滴加细胞悬浮，滴加0.8%戊二醛戊二醛0.1ml，混，混匀，匀，4冰箱中放置冰箱中放置15min。 涂片：取出上述细胞悬液后，再轻轻旋涂片：取出上述细胞悬液后，再轻轻旋转、搓捻混匀，推厚血片。转、搓捻混匀，推厚血片。 干燥：自然凉干。干燥：自然凉干。n瑞士干片染色：瑞士干片染色：n 滴滴35滴

8、瑞士染液，至盖满整个血片为止。滴瑞士染液，至盖满整个血片为止。n 约约40秒后，加秒后，加23倍蒸馏水，用洗耳球混匀。倍蒸馏水，用洗耳球混匀。n 约约3min后，用细流水冲洗，吸水纸吸干，后，用细流水冲洗，吸水纸吸干， 油镜下观察结果。油镜下观察结果。200n E-RFC100%E花结形成细胞百分率= 镜检：计数镜检：计数200个淋巴细胞，周围粘附个淋巴细胞，周围粘附3个个或或3个以上个以上SRBC的淋巴细胞为的淋巴细胞为E花结形成花结形成细胞（即细胞（即T细胞）。细胞）。 *注意事项：注意事项： 油镜使用后用擦镜纸拭干镜头，摆开物镜，油镜使用后用擦镜纸拭干镜头，摆开物镜，收箱。收箱。 实验材

9、料分配：（实验材料分配：（2人人/组）组）肝素管及淋巴细胞分离管 1支 /1组细胞计数板 1块/2组Hanks液 1瓶/列0.8%戊二醇 1瓶/班1%冰醋酸 1瓶/班绵羊红细胞 3瓶/班 流式细胞仪的细胞分析原理实验报告实验报告E-花结形成试验的原理、简要步骤、结果及其讨论。花结形成试验的原理、简要步骤、结果及其讨论。T淋巴细胞转化实验淋巴细胞转化实验 原理原理 淋巴细胞表面有有丝分裂原的受体。其中， PHA、ConA的受体为 T淋巴细胞所特有。当T淋巴细胞在体外培养时，加入PHA或ConA使其受到刺激， T淋巴细胞能转化为淋巴母细胞，同时伴有DNA、RNA及蛋白质合成的增加，最终导致细胞分裂。根据其转化率可测定T淋巴细胞的功能，从而反映机体的细胞免疫功能。 形态学方法 同位素法 MTT比色法 MTT即甲基四氮唑蓝，呈黄色。活细胞内线粒体脱氢酶能将它还原为蓝色结晶状甲Zan，甲Zan可溶于有机溶剂（盐酸异丙醇、二甲基亚砜或无水乙醇等），溶解后进行比色测定。甲Zan生成量（即颜色深浅）可反映细胞代谢活性强弱。正常细胞转化率为5070%。淋转基本基本方法PHA 活细胞