色谱学_lecture_5

1、色谱学色谱学第五讲第五讲2011年10月24日PolarityNon-polarPolar+-Polar vs. nonpolar Separation is based on the vapor pressure and polarity of the components. Within a homologous series (alkanes, alcohol, olefins, fatty acids) retention time increases with chain length (or molecular weight) Polar columns retain polar

2、compounds to a greater extent than non-polar C18 saturated vs. C18 saturated methyl ester C16:0C18:0C18:1C18:2C16:1C16:0C18:0C18:1C18:2C16:1RT (min)RT (min)Polar columnNon-polar columnPhases0.32 mm IDLiquid Stationary phaseMobile phase (Helium) flowing at 1 mL/minOpen Tubular Capillary Column15-60 m

3、 in length0.1-5 mmChromatograms Supelco PTE-5Supelco SPB-50 仪器型号：7890F进 样 器：填充柱进样器检 测 器：FID色 谱 柱：白酒分析专用填充柱进 样 量：1ul数据处理：KYS-688A积分仪浓香型白酒香味成份分析（填充柱）浓香型白酒香味成份分析（填充柱）仪器型号：7890F进 样 器：毛细管不分流进样器检 测 器：FID色 谱 柱：白酒分析专用毛细管柱进 样 量：0.3ul数据处理：KYS-688A积分仪浓香型白酒香味成份分析（毛细管）浓香型白酒香味成份分析（毛细管）仪器型号：7890E进 样 器：毛细管不分流进样器检 测

4、 器：ECD色 谱 柱：0.53毛细管柱进 样 量：0.2ul数据处理：T2000工作站12 3 4 5 67891. BHC， 2. BHC， 3. BHC， 4. BHC, 5.环氧七氯， 6.PP-DDE，7.OP-DDT， 8.PP-DDD， 9.PP-DDT。含氯农药残留分析实例含氯农药残留分析实例色谱法的分类色谱法的分类根据流动相的根据流动相的物态可分为物态可分为气相色谱气相色谱(GC)液相色谱液相色谱(LC)超临界流体色谱超临界流体色谱(SFC)根据分离机理根据分离机理可分为可分为吸附色谱吸附色谱分配色谱分配色谱离子交换色谱离子交换色谱排阻色谱排阻色谱亲和色谱亲和色谱根据固定相的

5、外形分根据固定相的外形分柱色谱柱色谱薄层色谱薄层色谱纸色谱纸色谱柱色谱：柱色谱：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸色谱：纸色谱：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层色谱：薄层色谱：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸色谱类似的方法进行物质的分离和鉴定。 纸色谱和薄层色谱主要适用于小分子物质的快速检纸色谱和薄层色谱主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱色谱是常用的色谱形式，适用于样品分析、分离。色谱是常用的色谱形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶色谱、离子交换色

6、谱、亲和生物化学中常用的凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱、高效液相色谱等都通常采用柱色谱形式。色谱、高效液相色谱等都通常采用柱色谱形式。Types of ChromatographyPaperHPLCGasThin layerColumn 薄 层 色 谱 法（Thin-layer chromatography,TLC)参考书籍：1 何华 倪坤仪 主编 现代色谱分析 化工出版社 2004 何丽一 平面色谱方法及应用 化工出版社 20053 杨银元 主编 实用仪器分析 北京大学出版社 2010概 述 1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色谱法”

7、一书，推动了这一技术的发展。 因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。 70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪器化，并实现了计算机化。特点：特点： 快，需十至几十分钟，同时展开多个快，需十至几十分钟，同时展开多个试样。试样。 试样预处理简单，对试样限制少。试样预处理简单，对试样限制少。 载样量比较大，适用于制备。载样量比较大，适用于制备。 仪器简单，操作方便。仪器简单，操作方便。 分离能力较强。分离能力较强。 灵敏度较高。灵敏度较高。薄层色谱参数保留参数（Rf值） 用来表征斑点位置的基本参数是保留因子

8、，通常称作比移值，用Rf表示。 Rf=Ls/L。，原点SRWLsL。Lr原点参比样品前沿用色谱学理论解释这个关系图薄层色谱法的主要类型和原理薄层色谱法的主要类型和原理 吸附薄层色谱法吸附薄层色谱法原理：组分在薄层板上吸附、解吸附、原理：组分在薄层板上吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的过程。再吸附、再解吸附的过程。吸附系数不等实现分离。吸附系数不等实现分离。一般极性强的组分一般极性强的组分K大，大，Rf值小；极性弱值小；极性弱的组分的组分 K小，小，Rf值大。值大。 分配薄层色谱法原理：多次分配的过程，分配系数（溶解度）不等实现分离分类：正相色谱、反相色谱正相色谱、反相色谱分配薄层色谱法 正相色谱

9、正相色谱：水为固定相（硅胶载体），有机：水为固定相（硅胶载体），有机溶剂为流动相。溶剂为流动相。极性强的组分极性强的组分K大，大， Rf值小。值小。 反相色谱反相色谱：烷基化学键合相为固定相，水：烷基化学键合相为固定相，水有机溶剂为流动相。有机溶剂为流动相。极性强的组分极性强的组分K小，小， Rf值大。值大。吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂 吸附剂吸附剂 硅胶硅胶：多孔性微粒，表面带有硅醇基，多孔性微粒，表面带有硅醇基，呈弱酸性。呈弱酸性。原理：硅醇基原理：硅醇基(吸附中心吸附中心)与极性基与极性基团形成氢键（吸附性）。团形成氢键（吸附性）。组分与硅醇基形成氢键（被吸附

10、）组分与硅醇基形成氢键（被吸附）的能力不同而分离。的能力不同而分离。应用：酸性和中性物质的分离，如应用：酸性和中性物质的分离，如有机酸酚类、醛类等有机酸酚类、醛类等 硅胶硅胶 活度与含水量的关系：含水量高，活性级高，活度与含水量的关系：含水量高，活性级高，活度低。活度低。 活化：加热至活化：加热至100左右，除去吸附水提高左右，除去吸附水提高活度。（注意温度不可过高）活度。（注意温度不可过高） 分离效率：与其粒度、孔径及表面积等有关。分离效率：与其粒度、孔径及表面积等有关。 常用硅胶：常用硅胶：硅胶硅胶H H，不含黏合剂，不含黏合剂硅胶硅胶G G，含煅石膏，含煅石膏硅胶硅胶GFGF254254

11、，含煅石膏和一种无机荧光剂，即锰激，含煅石膏和一种无机荧光剂，即锰激活的硅酸锌，在活的硅酸锌，在254nm254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。光背景。 吸附剂吸附剂 氧化铝氧化铝碱性氧化铝碱性氧化铝(pH9.0)分离中性或碱性化合分离中性或碱性化合物，如生物碱、脂溶性维生素等；物，如生物碱、脂溶性维生素等； 中性氧化铝中性氧化铝(pH7.5)分离酸性及对碱不稳分离酸性及对碱不稳定的化合物；定的化合物； 酸性氧化铝酸性氧化铝(pH4.0)酸性化合物的分离。酸性化合物的分离。活度也与含水量有关。活度也与含水量有关。薄层板未改性固定相 硅胶为使用最广泛的薄层材料 氧化铝有碱

12、性、中性、酸性 硅藻土为化学中性吸附剂 纤维素天然多糖类 聚酰胺为特殊类型有机薄层材料，对能形成氢键的物质有特别的选择性。表面改性固定相 疏水改性硅胶化学键合烷基 亲水改性硅胶引入氨基、氰基、二羟基等，薄层板极性介于极性吸附剂和疏水改性剂之间（极性次序：硅胶氨基氰基二羟基 反相）。 表面改性纤维素乙酰化纤维素药典收载的固定相有：硅胶类、硅藻土类、氧化铝类、微晶纤维素类等。颗粒直径一般要求10 40 um。载板玻璃板，放在饱和碳酸钠溶液中浸泡数小时，除去玻璃表面的油污。然后充分漂洗干净，干燥，置干燥器中备用。要求光滑、平整、洗净后不附水珠。 薄层板涂铺要求：均匀、平整、无气泡引起的凹坑和龟裂。例

13、：硅胶板（粒度10 40um） 硅胶G将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨均匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水(一般为1份固定相与3份水)，迅速研磨均匀，立即涂铺。 硅胶或硅胶G 以CMC为黏合剂。配制0.2% 0.7%CMC水溶液,放置过夜,使悬浮的纤维沉降,取上层用来配制吸附剂匀浆。反相薄层板制备以不同链长的 正构烷烃为固定液, 配制成适当浓度的溶液(如5%硅酮油乙醚溶液), 浸渍硅胶板。 薄层板活化涂布后的薄层先在室温下阴干，在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后置干燥器中备用。不同薄层活化条件略有不同，如： 硅胶 110 1h 氧化铝 110 30min 点样点样要求配制样品的溶剂

14、高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差，以最小检测量的几倍几十倍为宜。手工点样工具：定容玻璃毛细管（1 5ul），微量注射器。自动点样 Limomat IV 喷样仪样品溶液通过气流成雾状喷向薄层，移动板台，使在薄层上流下样品条带。特点：适合于大量稀样品溶液的喷加；条带宽度不超过2mm，有利于改善分辨率；便于狭缝式光密度计扫描；要求薄层板强度高。 自动薄层色谱点样仪由计算机控制。药典规定：点样基线距底边2.0cm, 样点直径2-4mm, 点间距离约为1.5-2.0cm。 展开方式多数采

15、用直线形上行展开，薄层板水平角度以75 为最佳。展开距离一般为10-15cm。多次展开一次展开未达满意分离时，可将薄层板干燥后再次用同一种溶剂展开，可重复多次，直到混合物分离为止。分步展开混合物性质差别较大时，一种流动相不能有效分离时，可采用不同溶剂依次展开不同距离。 连续展开使到达薄层上缘的溶剂不断蒸发，连续展开以增加展开距离。因无溶剂前沿，需要有个参照物同时展开，以计算相对保留值。 二维展开在两个垂直的方向上进行展开。将样品点在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂，再将薄层板以与原展开方向成90 的方向进行展开。原点12显色和定位显色和定位：光学光学检出：可见光下不显色、但可吸收紫外

16、检出：可见光下不显色、但可吸收紫外光吸紫外光、显荧光斑点荧光薄层板光吸紫外光、显荧光斑点荧光薄层板蒸气蒸气显色：碘、挥发性酸碱盐酸、硝酸、显色：碘、挥发性酸碱盐酸、硝酸、浓氨水、二乙胺浓氨水、二乙胺试剂试剂显色法：喷雾和浸渍显色法：喷雾和浸渍显色剂：常用硫酸、碘、磷钼酸、三氯显色剂：常用硫酸、碘、磷钼酸、三氯化锑化锑专属改良碘化鉍钾、香草醛专属改良碘化鉍钾、香草醛硫酸硫酸流动相与展开体系 液-固吸附 在该色谱中，溶质的保留和分离选择性决定于三个因素：流动相溶质吸附剂竞争竞争 液-液分配 基于组分在互不相溶的两相间的溶解度不同而实现分离的一种展开系统。可在展开前，将薄层板浸入某种液体固定相。实际

17、上在TLC中，分配与吸附是并存的（大气中水分也是一种固定相）。 此外还有：化学键合相反相展开、化学键合相正相展开、离子交换、离子对色谱、凝胶、胶束、手性展开。 溶剂强度参数和选择性溶剂的强度参数定义：溶剂强度参数用表示。流动相强度越高，表示它与吸附剂相互作用力强。溶质的Rf值就越大。为得到满意的分离，选用的流动相使溶质的Rf值在0.2 0.7之间为宜。溶剂强度也可用其在水中的溶解度参数 来表示。 一些常用溶剂的溶剂强度与溶解度参数 溶剂 溶剂 正己烷 0.01 7.3 环己烷 0.04 8.2 苯 0.32 9.2 乙醚 0.38 7.4 二氯甲烷 0.42 9.6 正丙醇 0.82 10.2

18、 正丁醇 0.70 / 四氢呋喃 0.57 9.1 乙酸乙酯 0.58 8.6 氯仿 0.40 9.1 甲乙酮 0.51 / 二氧六环 0.56 9.8 吡啶 0.71 10.4 丙酮 0.50 9.4 乙醇 0.88 / 乙酸 1.00 12.4 二甲亚砜 0.75 12.8 甲醇 0.95 12.9 乙二醇 1.11 14.7 甲酰胺 / 17.9 展开剂展开剂( (流动相流动相) )同吸附柱色谱同吸附柱色谱极性强的溶剂洗脱能力强极性强的溶剂洗脱能力强常用溶剂的极性强弱顺序：常用溶剂的极性强弱顺序：水酸吡啶甲醇乙醇正水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿丙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷

19、甲苯苯三氯乙烷二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳四氯化碳 环己烷环己烷 石油醚。石油醚。 展开剂展开剂选择原则：选择原则：根据被分根据被分离物质的极性离物质的极性StahlStahl简图：极性物简图：极性物质质活度低（活性活度低（活性级大）的吸附剂级大）的吸附剂-极性展开剂极性展开剂 展开剂展开剂 混合溶剂混合溶剂先用单一溶剂展开，先用单一溶剂展开，若若R Rf f值太小，则加入一定量极性强的溶剂，如值太小，则加入一定量极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等，乙醇、丙酮等，如果如果R Rf f值太大，则加入适量极性弱的溶剂值太大，则加入适量极性弱的溶剂( (如如环己烷、石油醚等环己烷、石油醚等) )，以降低

20、极性。，以降低极性。可加入一定比例的酸或碱可加入一定比例的酸或碱, ,使斑点集中。使斑点集中。薄层扫描 原理 薄层定量方法可分为直接法测定照射光照射色谱后，因被测物斑点的存在引起的透射光和反射光的变化。并通过随行标准比较待测斑点的量。间接法将部分照射光的能量转换成较长波长的荧光，即荧光测量。 薄层色谱定量测定的光学方法是基于测量斑点和薄层空白处光学响应信号的差值。 一强度为I的光照射薄层时，被照射的一面为“近表面”，另一面为“远表面”。近表面远表面光（I）镜反射或表面反射Is(表面平滑)漫反射(表面粗糙)入射强度I0 出射强度(IT )IT / I0T返回光强(IR )IR / I0RI0 -

21、（ IR + IT ）=差为被介质吸收并转换为热的光强 光学系统 薄层色谱扫描仪光学系统有三种 单光束单波长受光源稳定性和薄层质量影响严重。 单光束双波长对背景不均匀引起的干扰有补偿作用，选择的两个波长应接近些。 双光束单波长可补偿光源不稳引起的误差，但对板层不均匀无作用。光单色器检测器光波长1波长2检测器斩波器光单色器分光镜检测器检测器 透射光法 测定组分对应的斑点对特定波长光的吸收度来确定含量。将薄层板从左至右移动，对斑点扫描，单色光透过薄层板后被记录下来，将测得的吸收度对Rf值绘制扫描曲线，得薄层色谱图光源单色器 反射光法 一定波长的光照射薄层，穿进薄层内的光部分被薄层吸收，部分经过漫反

22、射又折回表面成为反射光。当对薄层进行扫描时，测量其反射吸收度，可得到反射光谱。反射吸收度与物质含量有确定关系，可进行定量。光源单色器 测量方式 吸光度测量测定的是漫反射光。适合于本身有颜色或有紫外吸收的物质。I0IR 检 测 器 荧光测量灵敏度较吸光度测量高，板层不吸收发射光，测量噪音小，基线稳定。为消除激发光的影响，在板层和检测器之间必须加一块滤光片，以截去反射激发光，只让发射的荧光抵达检测器。滤光片荧光 检 测 器 荧光淬灭测量吸附剂有荧光，样品斑点无荧光，在紫外光照射下，被测物在荧光背景上显示出暗灰斑点。本法适合于本身无颜色，又无特征紫外吸收或荧光的物质。该测量技术有三种形式：测荧光测紫

23、外光测紫外和荧光 扫描仪 机械扫描仪可进行吸光度和荧光测量，以反射测量方式为主，也有能提供透射测量方式的（主要用于电泳谱图扫描测量）。 高速扫描系统可分为两类 光栅扫描系统 位敏扫描系统 这类扫描仪技术上一些问题还未解决。定性、定量方法 定性方法 利用保留值 测定Rf值 测定相对Rf值，即Rx值。 利用二维色谱（改变色谱条件，比较Rf值是否一致） sb1b2b2sb1sb1b2点样第一次展开第二次展开通过板上化学反应 反应后生成特征颜色的化合物 反应后生成复杂的混合物，根据生成物的“指纹”特征加以鉴定。 可用于定性的板上反应有：乙酰化、浓硫酸脱水、偶氮化、酯化、卤化、酸碱水解、硝化、氧化还原、

24、热解和光化学反应等。通过加热、喷雾等方法施加反应试剂。通过板上光谱图定性 直接测定薄层板上斑点的紫外或可见吸收光谱图，与平行点加的标准斑点的图谱对照。 可建立标准条件下的化合物的光谱图库，用计算机检索定性。与其他技术连用 TLC-付里叶变换IR联用 TLC-MS联用 定量方法间接定量将薄层分离后物质斑点定量地洗脱下来，再对洗脱液定量。 分光光度法、HPLC法、GC法、质谱法直接定量 斑点面积测量用透明纸覆盖在薄层表面，描出斑点界限，然后测量其面积。 目测法比较系列标准与样品的斑点面积大小、颜色深浅，得到样品的含量范围。薄层仪扫描定量 定量计算 归一化法、内标法、外标法 方法认证 选择性以分离度

25、表示，当待测组分的Rf值在0.3 0.7之间，扫描峰拖尾因子在0.9 1.1之间时可以接受的分离度为R大于等于1.0 稳定性考察在采样、样品预处理、贮存、展开，展开后处理等过程中的样品稳定性。 线性与范围相应于待测组分检出量的20% - 120%范围。 灵敏度通常以标准曲线的斜率表示。DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析聚酰胺是聚酰胺是类化学纤维原料，即锦纶类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙又称尼龙)。由己二酸与己二胺聚合。由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶而成的称锦纶66 。 因为在这类物质分子中都含有大量酰胺因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。基团，故统称聚酰胺。聚酰胺对很多极

26、性物质有吸附作用，这是由于聚酰聚酰胺对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一胺的一CO及及NH基能与被分离物质之间形成氢基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等包括黄酮类、鞣质等)和酸类和酸类如核苷如核苷酸、氨基酸等酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，确定成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。在层析过程中，层层溶剂与被吸附能力的差异。在层析过程中，层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成

27、氢键。因此选择分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离解吸的展层过程，可以一一分离. DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析 二甲氨基萘磺酰氯二甲氨基萘磺酰氯（1-Dimethylaminonaphtalene-5-sulfonyl chloride）简称）简称DNS-Cl，可与氨基酸的游，可与氨基酸的游离氨基结合成离氨基结合成DNS-氨基酸，形成的氨基酸，形成的DNS-氨氨基

28、酸在紫外线（基酸在紫外线（260nm或或365nm）照射下）照射下发出强烈的黄色荧光，因此可用荧光检测发出强烈的黄色荧光，因此可用荧光检测DNS-氨基酸的存在。反应过程如下：氨基酸的存在。反应过程如下：荧光试剂：荧光试剂：DNS-Cl二甲氨基萘磺酰氯二甲氨基萘磺酰氯蛋白质、多肽、氨基酸可与其游离氨基结合，蛋白质、多肽、氨基酸可与其游离氨基结合，DNS-aa发出黄绿色荧光发出黄绿色荧光DNS-Cl在在pH过高时，水解产生过高时，水解产生副产物副产物DNS-OH，即：，即：在在DNS-C1过量时，会产生过量时，会产生DNSNH2，即：，即：DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现氨基酸在紫外光照射下呈现黄