无病毒苗的培育

1、LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 一、病毒在植物上的危害 危害植物的病毒有几百种， 且随着生产栽培时间的延长，危害越来越甚， 种类越来越多。以种子进行繁殖的种类，除豆类外， 可随着世代的交替而去除病毒，即病毒只能危害一个世代；而行无性繁殖的种类， 由于病毒通过营养体进行传递，在母株内逐代积累，危害日趋严重。一些园艺植物以小规模集约栽培，造成连作危害问题，并加重土壤传染性病毒的危害。 LifeLife Science Science & Plant& Plan

2、t Tissue Culture Tissue Culture 病毒的危害给作物生产带来重大的损失。 如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低， 品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产1018%，为害马铃薯有几十种病毒， 给马铃薯生产带来严重障碍。花卉上病毒的危害大大影响其观赏价值，表现花少而小，产生畸形、变色等。LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 为了提高作物的产量和质量，根除病毒和其它病为了提高作物的产量和质量，根除病毒和其它病原菌是非常必要的。原菌是非常必要的。 但现在还没有

3、什么药物可治愈受病毒侵染的植物。但现在还没有什么药物可治愈受病毒侵染的植物。若一个无性系的整个群体都已受到侵染，若一个无性系的整个群体都已受到侵染， 获得无病获得无病毒植株的唯一方法就是消除营养体的病原菌，毒植株的唯一方法就是消除营养体的病原菌， 并由并由这些组织中再生出完整的植株。一旦获得了一个不带这些组织中再生出完整的植株。一旦获得了一个不带病原菌的植株，病原菌的植株， 就可在不致受到重新侵染的条件下就可在不致受到重新侵染的条件下，对它进行营养繁殖。用组织培养法消除病毒是唯一，对它进行营养繁殖。用组织培养法消除病毒是唯一行之有效的方法。行之有效的方法。LifeLife Science Sc

4、ience & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 二、无病毒苗培育的意义二、无病毒苗培育的意义 采用生物、物理、化学等途径防治病毒病收效甚微采用生物、物理、化学等途径防治病毒病收效甚微，甚至毫无成效。自从，甚至毫无成效。自从50年代发现通过组织培养的方年代发现通过组织培养的方法可以脱除严重患病毒植物的病毒种类，提高产量、法可以脱除严重患病毒植物的病毒种类，提高产量、质量后（如草莓可增产质量后（如草莓可增产2050，植株结果多，单果，植株结果多，单果重增加，上等果比例提高。菊花切花品种的脱毒株，重增加，上等果比例提高。菊花切花品

5、种的脱毒株，表现出株高增加，切花数增多，花朵大，切花较重）表现出株高增加，切花数增多，花朵大，切花较重）。因此到。因此到60至至70年代组织培养的技术在花卉、蔬菜和年代组织培养的技术在花卉、蔬菜和果树等得到广泛的应用。果树等得到广泛的应用。LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 一、茎尖培养脱毒一、茎尖培养脱毒 感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀， 病病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端

6、区域的病毒的感染深度越低，生长点（约的病毒的感染深度越低，生长点（约0.11.0mm区区域）则几乎不含或含病毒很少。这是因为分生区域内域）则几乎不含或含病毒很少。这是因为分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递， 赶不上细赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。在切取茎尖时越小越胞不断分裂和活跃的生长速度。在切取茎尖时越小越好，好， 但太小则不易成活，过大则不能保证完全除去但太小则不易成活，过大则不能保证完全除去病毒。病毒。 茎尖培养脱毒，茎尖培养脱毒， 由于其脱毒效果好，后代稳定由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗的最广泛最重要的一个途，所以

7、是目前培育无病毒苗的最广泛最重要的一个途径。径。LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 茎尖培养脱毒LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 二、培养基二、培养基 一般以一般以White、 Morel和和MS培养基作为基培养基作为基本培养基，尤其是提高钾盐和铵盐含量有利于茎本培养基，尤其是提高钾盐和铵盐含量有利于茎尖的生长。尖的生长。 MS培养基对某些植物的茎尖培养培

8、养基对某些植物的茎尖培养时，其中有些离子浓度过高应予以稀释。时，其中有些离子浓度过高应予以稀释。 植物激素的种类与浓度对茎尖生长和发育具有植物激素的种类与浓度对茎尖生长和发育具有重要的作用。在双子叶植物植物激素大概是在第重要的作用。在双子叶植物植物激素大概是在第2对最年幼的叶原基中合成，对最年幼的叶原基中合成， 所以茎尖的圆锥组织所以茎尖的圆锥组织生长激素不能自给，必须提高适当浓度的生长素生长激素不能自给，必须提高适当浓度的生长素(0.10.5mg/L)与细胞分裂素，在生长素中应避免与细胞分裂素，在生长素中应避免使用易促进愈伤组织化的使用易促进愈伤组织化的2,4D，宜换用稳定性较，宜换用稳定性

9、较好的好的NAA或或IBA，细胞分裂素可用，细胞分裂素可用KT或或BA。GA3对某些植物茎尖培养是有用的。有时茎尖培养添加对某些植物茎尖培养是有用的。有时茎尖培养添加活性炭。活性炭。 茎尖培养中，茎尖培养中， 由于操作方便，一般都由于操作方便，一般都使用琼脂培养基。不过，在琼脂培养基能诱使用琼脂培养基。不过，在琼脂培养基能诱导外植体愈伤组织化的情况下，最好还是用导外植体愈伤组织化的情况下，最好还是用液体培养基。在进行液体培养时，须制作一液体培养基。在进行液体培养时，须制作一个滤纸桥，把桥的两臂浸入试管内的培养基个滤纸桥，把桥的两臂浸入试管内的培养基中，桥面悬于培养基上，外植体放在桥面上中，桥面

10、悬于培养基上，外植体放在桥面上。LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 三、茎尖培养方法三、茎尖培养方法 进行脱毒培养时，进行脱毒培养时， 由于微小的茎尖组织很难靠由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作，因而需要一台带有适当光源的简单的解剖肉眼操作，因而需要一台带有适当光源的简单的解剖镜镜(840X)。除了在进行植物组织无菌培养一般工具。除了在进行植物组织无菌培养一般工具外，外， 还需要一套解剖刀。剥离茎尖时，应尽快接种还需要一套解剖刀。剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露的时间应当越短越

11、好，茎尖暴露的时间应当越短越好， 以防茎尖变干。以防茎尖变干。可在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，有助可在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，有助于防止茎尖变干。于防止茎尖变干。 一般来说，茎尖分生组织由和其它器官的培养一般来说，茎尖分生组织由和其它器官的培养一样，一样， 在进行茎尖培养时，首要一步是获得表面在进行茎尖培养时，首要一步是获得表面不带病原菌的外植体。不带病原菌的外植体。 一般来说，茎尖分生组织一般来说，茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严密保护，只要仔细解由于有彼此重叠的叶原基的严密保护，只要仔细解剖，无须表面消毒就应当能得到无菌的外植体。剖，无须表面消毒就应当能得到无

12、菌的外植体。 有时消毒处理仅会增加培养物的污染率。选取茎尖有时消毒处理仅会增加培养物的污染率。选取茎尖前，可把供试植株种在无菌的盆土中，前，可把供试植株种在无菌的盆土中， 放在温室放在温室中进行栽培。浇水时要直接浇在土壤中而不要浇在中进行栽培。浇水时要直接浇在土壤中而不要浇在叶片上。叶片上。 另外，最好还要给植株定期喷施内吸杀另外，最好还要给植株定期喷施内吸杀菌剂，可用多菌灵菌剂，可用多菌灵(0.1%) 和抗生素（如和抗生素（如0.1%链霉链霉素）。对于某些田间种植的材料，可以切取插条插素）。对于某些田间种植的材料，可以切取插条插入入Knop溶液中令其长大，溶液中令其长大， 由这些插条的腋芽长

13、由这些插条的腋芽长成的枝条，要比由田间植株上直接取来的枝条污染成的枝条，要比由田间植株上直接取来的枝条污染小得多。小得多。 于有彼此重叠的叶原基的严密保护，只要仔细于有彼此重叠的叶原基的严密保护，只要仔细解剖，无须表面消毒就应当能得到无菌的外植体。解剖，无须表面消毒就应当能得到无菌的外植体。 有时消毒处理仅会增加培养物的污染率。选取茎有时消毒处理仅会增加培养物的污染率。选取茎尖前，可把供试植株种在无菌的盆土中，尖前，可把供试植株种在无菌的盆土中， 放在温放在温室中进行栽培。浇水时要直接浇在土壤中而不要浇室中进行栽培。浇水时要直接浇在土壤中而不要浇在叶片上。在叶片上。 另外，最好还要给植株定期喷

14、施内吸另外，最好还要给植株定期喷施内吸杀菌剂，可用多菌灵杀菌剂，可用多菌灵(0.1%) 和抗生素（如和抗生素（如0.1%链链霉素）。对于某些田间种植的材料，可以切取插条霉素）。对于某些田间种植的材料，可以切取插条插入插入Knop溶液中令其长大，溶液中令其长大， 由这些插条的腋芽由这些插条的腋芽长成的枝条，要比由田间植株上直接取来的枝条污长成的枝条，要比由田间植株上直接取来的枝条污染小得多。染小得多。 LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 为了保险起见，在切取外植体之前一般仍须对

15、茎芽进行表为了保险起见，在切取外植体之前一般仍须对茎芽进行表面消毒。叶片包被严紧的芽，如菊花，兰花，只须在面消毒。叶片包被严紧的芽，如菊花，兰花，只须在75%酒精酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，如香石竹，蒜和马铃薯等中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，如香石竹，蒜和马铃薯等，则要用，则要用0.1%次氯酸钠表面消毒次氯酸钠表面消毒10分钟。对于这些消毒方法分钟。对于这些消毒方法，在工作中应灵活运用，如在大蒜茎尖培养时，可将小鳞茎在，在工作中应灵活运用，如在大蒜茎尖培养时，可将小鳞茎在75%酒精中浸蘸一下，再用灯火烧掉酒精，然后解剖出无菌茎酒精中浸蘸一下，再用灯火烧掉酒精，然后解剖出无菌茎芽。芽。

16、 在剖取茎尖时，把茎芽置于解剖镜下，一手用细镊子将在剖取茎尖时，把茎芽置于解剖镜下，一手用细镊子将其按住，另一手用解剖针将叶片和叶原基剥掉，解剖针要常其按住，另一手用解剖针将叶片和叶原基剥掉，解剖针要常常蘸入常蘸入90%酒精，并用火焰灼烧以进行消毒。但要注意解剖酒精，并用火焰灼烧以进行消毒。但要注意解剖针的冷却，可蘸入无菌水进行冷却。当一个闪亮半圆球的顶针的冷却，可蘸入无菌水进行冷却。当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来，为了提高成活率，可带来，为了提高成活率，可带12枚幼叶，然后将其接到培养枚幼叶，然后

17、将其接到培养基上。基上。 接种时确保微茎尖不与其他物体接触，只用解剖针接种时确保微茎尖不与其他物体接触，只用解剖针接种即可。接种即可。将接处好的茎尖置于将接处好的茎尖置于22左右的温度。每天左右的温度。每天16小时小时20003000Lx的光照条件下培养。由于在低温和短日照下，茎尖的光照条件下培养。由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月培养才能成功。证。微茎尖需数月培养才能成功。LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue

18、Culture Tissue Culture 四、影响微茎尖培养的因素四、影响微茎尖培养的因素外植体大小外植体大小 在最适培养条件下，外植体的大小决定茎尖的存活率，外在最适培养条件下，外植体的大小决定茎尖的存活率，外植体越大，产生再生植株的机会也就越多，而外植体越小脱毒植体越大，产生再生植株的机会也就越多，而外植体越小脱毒效果越好。除了外植体的大小之外，叶原基的存在与否也影响效果越好。除了外植体的大小之外，叶原基的存在与否也影响分生组织形成植株的能力，一般认为，叶原基能向分生组织提分生组织形成植株的能力，一般认为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。在含有必要的生供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。在含有必要的生长调节物质的培养基中，离体顶端分生组织能在组织重建过程长调节物质的培养基中，离体顶端分生组织能在组织重建过程中迅速形成双极性两端。中迅速形成双极性两端。 LifeLife Science Science & Plant& Plant Tissue Culture Tissue Culture 培养条件培养条件 在茎尖培养中，照光培养的效果通常比暗培养好