无病毒苗木的培育

1、第三章第三章 组织培养技术组织培养技术 第六节第六节 植物无病毒苗的培育植物无病毒苗的培育 脱毒技术在菠萝、香蕉、草莓、马铃薯、菊花、香石竹、唐菖蒲、水仙、郁金香、百合、大丽花、白鹤芋等主要园艺作物上已成功应用。从根本上解决了植物的退化问题。 一、一、 无病毒苗培育的意义无病毒苗培育的意义 二、二、 培育无病毒苗木的方法培育无病毒苗木的方法 三、三、 无病毒苗木的鉴定无病毒苗木的鉴定2、病毒在植物上的危害、病毒在植物上的危害 病毒的危害给植物生产带来的损失很大，如草莓病病毒的危害给植物生产带来的损失很大，如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄毒的危害，使草莓产量严重降低，品质

2、大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产扇叶病毒使葡萄减产1018，花卉病毒的危害一般，花卉病毒的危害一般会影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、会影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、变色等。变色等。 由于病毒对植物造成如此严童的危害，所以世界各由于病毒对植物造成如此严童的危害，所以世界各国都积极开始重视这方面的研究。国都积极开始重视这方面的研究。 3、无病毒苗培育的意义、无病毒苗培育的意义 1. 去除病毒危害，提高作物品质与产量。去除病毒危害，提高作物品质与产量。采用生物、物理、采用生物、物理、化学等途径防治病毒病收效甚微，甚至毫无成效。而通过化学等途径防治病毒病收效甚微，甚至

3、毫无成效。而通过组织培养的方法可以脱除严重患病毒植物的病毒种类，提组织培养的方法可以脱除严重患病毒植物的病毒种类，提高产量、质量。因此，到高产量、质量。因此，到60至至70年代在花卉、蔬菜和果年代在花卉、蔬菜和果树等得到广泛的应用。树等得到广泛的应用。 2. 减少环境污染，有利于保护环境减少环境污染，有利于保护环境. 栽培去病毒植物可栽培去病毒植物可减少药剂的使用。减少药剂的使用。二、二、 无病毒苗培育的方法无病毒苗培育的方法 1、热处理脱毒、热处理脱毒 2、微茎尖培养脱毒、微茎尖培养脱毒 3、其他途径脱毒、其他途径脱毒 1、热处理脱毒、热处理脱毒 发现：发现： 18891889年印度尼西亚爪

4、畦人发现，患枯萎病的年印度尼西亚爪畦人发现，患枯萎病的甘蔗甘蔗( (现证明为病毒病现证明为病毒病) )，放在，放在50-5250-52的热水中的热水中保持保持30min30min，甘蔗就可去病生长良好。以后此方，甘蔗就可去病生长良好。以后此方法被广泛用于防治许多植物的病毒病。法被广泛用于防治许多植物的病毒病。 热处理又称温治疗法。热处理又称温治疗法。 原理：原理： 是当植物组织处于高于正常温度的环境中是当植物组织处于高于正常温度的环境中时，组织内部的时，组织内部的病毒受热后部分或全部钝化，病毒受热后部分或全部钝化，不能生成或生成病毒很少，以致病毒含量不断不能生成或生成病毒很少，以致病毒含量不断

5、降低从而达到脱毒的目的降低从而达到脱毒的目的 。 热处理方法热处理方法 （1） 温汤浸渍处理温汤浸渍处理 F 适用：休眠器官、剪下的接穗或种植的材料适用：休眠器官、剪下的接穗或种植的材料F 方法方法：50左右的温水中浸渍左右的温水中浸渍10min至数小时至数小时F 特点：方法简便易行，但易使材料受伤。特点：方法简便易行，但易使材料受伤。 （2） 热空气处理热空气处理 F 适用：适用：对活跃生长的茎尖效果较好对活跃生长的茎尖效果较好F 方法：方法：将生长的盆栽植株移人温热治疗室将生长的盆栽植株移人温热治疗室(箱箱)内，一般内，一般在在3540下处理几十分钟至数月。处理时间因植物而异，下处理几十分

6、钟至数月。处理时间因植物而异，如香石竹于如香石竹于38下处理两个月，其茎尖所含病毒即可被清除。下处理两个月，其茎尖所含病毒即可被清除。马铃薯在马铃薯在35下处理几个月才能获得无病毒苗。下处理几个月才能获得无病毒苗。F 特点：特点：热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒。例热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒。例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒。因此热处如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒。因此热处理需与其他方法配合应用，才可获得良好的脱毒效果理需与其他方法配合应用，才可获得良好的脱毒效果 。 2、微茎尖培养脱毒、微茎尖培养脱毒 茎尖培养脱毒原理茎尖培养脱毒原理 感染病毒植株的

7、体内病毒的分布不均匀，病毒的数感染病毒植株的体内病毒的分布不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染程度越低，生长点染程度越低，生长点(分生组织约分生组织约0.11.0mm区域区域)则几乎则几乎不含或含病毒很少。不含或含病毒很少。 茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。 植物组织内病毒含量随与茎尖距离加大而增加的原因植物组织内病毒含量随与茎尖距离加大而增加的原因 在植物体内，病毒

8、易于通过微管系统移动，但分生在植物体内，病毒易于通过微管系统移动，但分生组织中无此系统；病毒在细胞间移动的另一个途径组织中无此系统；病毒在细胞间移动的另一个途径是通过胞间连丝，但它的速度极慢，难以赶上活跃是通过胞间连丝，但它的速度极慢，难以赶上活跃生长的茎尖。生长的茎尖。 活跃生长的茎尖分生组织代谢活性很高，致使病毒活跃生长的茎尖分生组织代谢活性很高，致使病毒无法复制无法复制。 若植物体内存在病毒钝化系统，它在分生组若植物体内存在病毒钝化系统，它在分生组织中比在任何其它区域都有更高的活性而钝化织中比在任何其它区域都有更高的活性而钝化病毒，使分生组织不受浸染。病毒，使分生组织不受浸染。 茎尖分生

9、组织存在较高水平的内源生长素，茎尖分生组织存在较高水平的内源生长素，可抑制病毒的增殖。可抑制病毒的增殖。 培养基培养基F 培养基：培养基： 一般以一般以White、Morel和和MS作为基本培作为基本培养基，尤其是提高钾盐和铵盐的含量会有利于茎尖的养基，尤其是提高钾盐和铵盐的含量会有利于茎尖的生长。生长。 F 植物激素：植物激素： 其种类与浓度对茎尖生长和发育具有其种类与浓度对茎尖生长和发育具有重要的作用。适当提高生长素重要的作用。适当提高生长素(0.10.5 mg/L)与细胞与细胞分裂素的浓度，避免使用易促进愈伤组织化的分裂素的浓度，避免使用易促进愈伤组织化的2，4-D，宜换用稳定性较好的宜

10、换用稳定性较好的NAA或或IBA，细胞分裂素可用，细胞分裂素可用Kt或或 BA。有时需添加活性炭。有时需添加活性炭。 微茎尖培养方法微茎尖培养方法外外植植体体茎尖茎尖（shoot tip）茎的顶端分生组织茎的顶端分生组织（apical meristem）顶端分生组织及其下方顶端分生组织及其下方13个幼叶原基构成个幼叶原基构成茎的最幼龄叶原基上方茎的最幼龄叶原基上方的一部分，最大直径约的一部分，最大直径约100um,最大长度约最大长度约250um（1） 外植体的预处理外植体的预处理 将带幼叶的茎芽叶片在将带幼叶的茎芽叶片在75酒精中浸蘸数秒钟酒精中浸蘸数秒钟（叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花）或用

11、（叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花）或用01次次氯酸钠表面消毒氯酸钠表面消毒l0min（叶片包被松散的芽，如香石（叶片包被松散的芽，如香石竹，蒜和马铃薯等）。竹，蒜和马铃薯等）。 （2） 茎尖的剥离与接种茎尖的剥离与接种 在解剖镜下，将灭菌的外植体放在一个衬有无在解剖镜下，将灭菌的外植体放在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内（防止茎尖变干菌湿滤纸的培养皿内（防止茎尖变干 ），用解剖），用解剖针将叶片和叶原基剥掉，当一个闪亮半圆球的顶端针将叶片和叶原基剥掉，当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来织切下来(0.20.5mm)，

12、可带，可带12枚幼叶，然后将枚幼叶，然后将其接种到培养基上。其接种到培养基上。 注意：注意：剥离与接种尽量要快，以防茎尖变褐死亡。剥离与接种尽量要快，以防茎尖变褐死亡。 （3 3）培养条件）培养条件F 温度：温度：2222左右左右F 光强：光强：20003000Lx20003000LxF 光照时间：每天光照时间：每天16h 16h 。F 微茎尖需数月培养才能成功。微茎尖需数月培养才能成功。F 茎尖培养的继代培养和生根培茎尖培养的继代培养和生根培 养和一般器官的培养相同。养和一般器官的培养相同。 由于在低温和短日由于在低温和短日照下，茎尖有可能照下，茎尖有可能进入休眠；所以较进入休眠；所以较高的

13、温度和充足的高的温度和充足的日照时间必须保证。日照时间必须保证。 影响微茎尖培养的因素影响微茎尖培养的因素 （1） 外植体大小外植体大小 外植体越大，茎尖越易成活，分化率越高，外植体越大，茎尖越易成活，分化率越高，产生再生植株的机会越大，但脱毒效果越差；产生再生植株的机会越大，但脱毒效果越差； 外植体越小，茎尖越难成活，分化率越低，产外植体越小，茎尖越难成活，分化率越低，产生再生植株的机会越小，但脱毒效果越好。生再生植株的机会越小，但脱毒效果越好。 （2）培养条件）培养条件 在茎尖培养中，较高的温度和充足的光照有利在茎尖培养中，较高的温度和充足的光照有利于茎尖的培养。于茎尖的培养。 光下培养的

14、效果通常比暗培养效果好，如马铃光下培养的效果通常比暗培养效果好，如马铃薯茎尖培养时，当茎已长到薯茎尖培养时，当茎已长到1cm高时光照强度便增高时光照强度便增加到加到4000Lx。 （3）外植体的生理状态）外植体的生理状态F 最好取顶芽：最好取顶芽：旺盛生长的枝条顶芽比侧芽培旺盛生长的枝条顶芽比侧芽培养效果好（养效果好（ 如香石竹和菊花）。如香石竹和菊花）。F 宜选取萌动期的芽：宜选取萌动期的芽：取芽时间很重要，否则取芽时间很重要，否则要采用某种适当的处理、打破休眠才能进行。要采用某种适当的处理、打破休眠才能进行。 3、其他途径脱毒、其他途径脱毒（1）愈伤组织培养脱毒）愈伤组织培养脱毒 通过植物

15、的器官和组织的培养去分化诱通过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗 （2）茎尖微体嫁接）茎尖微体嫁接 概念：概念：将无病毒茎尖（将无病毒茎尖（ 0.41.0mm ）嫁接在培养基）嫁接在培养基上培养的实生砧木上，以获得脱毒苗木的技术。上培养的实生砧木上，以获得脱毒苗木的技术。 适宜适宜：茎尖培养难以生根的植物，如桃、柑橘、苹茎尖培养难以生根的植物，如桃、柑橘、苹 果等果等 无病毒茎尖来源：无病毒茎尖来源：成年无病毒植物、温室培养的植成年无病毒植物、温室培养的植

16、物、热处理植物和脱毒试管苗物、热处理植物和脱毒试管苗。（3）化学疗法脱毒）化学疗法脱毒F 许多化学药品许多化学药品(包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等抗菌素等)对离体组织和原生质体的培养具有脱毒对离体组织和原生质体的培养具有脱毒效果。效果。F 常用的药品有：常用的药品有：8-氮鸟嘌呤、氮鸟嘌呤、2-硫脲嘧啶、杀硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、放线菌素稻瘟抗菌素、放线菌素D、庆大霉素等。、庆大霉素等。F 例如，将例如，将100ug2-硫脲嘧啶加入培养基可除去硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的烟草愈伤组织中的PVY (马铃薯病毒马铃薯病毒)。 三、三、 无病毒苗木的

17、鉴定无病毒苗木的鉴定 从上述途径培育得到的植株，必须经严格鉴定，证明确从上述途径培育得到的植株，必须经严格鉴定，证明确实无病毒存在，才是其真正的无病毒苗，才可提供给生产应实无病毒存在，才是其真正的无病毒苗，才可提供给生产应用。用。 鉴定的方法有多种：鉴定的方法有多种： 指示植物指示植物(indicating Plant)(indicating Plant)法法 抗血清抗血清(antiserum)(antiserum)鉴定法鉴定法 电子显微镜电子显微镜(electric microscope)(electric microscope)检查法检查法 一、指示植物法一、指示植物法 （1） 概念：概念

18、：利用病毒在其他植物（指示植物或鉴利用病毒在其他植物（指示植物或鉴别寄主）上产生特定症状（枯斑和空斑）作为鉴别寄主）上产生特定症状（枯斑和空斑）作为鉴别病毒存在与否和种类的方法。别病毒存在与否和种类的方法。 （2）局限性：）局限性：它只能鉴定靠汁液传染的病毒。它只能鉴定靠汁液传染的病毒。 （3）适用：）适用：草本与木本植物草本与木本植物 （4）优点：）优点：灵敏、准确、可靠，操作方便灵敏、准确、可靠，操作方便。 （5）鉴定方法：）鉴定方法：F 汁液涂抹法：汁液涂抹法：从被鉴定植物上取从被鉴定植物上取13g幼叶幼叶 研碎研碎过滤过滤取滤液涂抹于指示植物的叶面上取滤液涂抹于指示植物的叶面上保温保温

19、1525 接种后接种后26d 可见症状出现可见症状出现 。F 嫁接接种法：嫁接接种法：以指示植物作砧木，被鉴定植物以指示植物作砧木，被鉴定植物作接穗，常用劈接法。作接穗，常用劈接法。 二、抗血清鉴定法二、抗血清鉴定法 1. 原理：原理： 植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白，是一种较好的抗原，给动物注射后会产白，是一种较好的抗原，给动物注射后会产生抗体，抗体存在于血清之中称抗血清。不生抗体，抗体存在于血清之中称抗血清。不同病毒产生的抗血清有各自的特异性。用已同病毒产生的抗血清有各自的特异性。用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。

20、2. 鉴定方法：鉴定方法： 抗原的制备抗原的制备 抗血清的采收，分抗血清的采收，分离离把稀释的抗血清与未知的病毒植物把稀释的抗血清与未知的病毒植物的汁液在小试管内混合的汁液在小试管内混合根据沉淀反应根据沉淀反应来鉴定病毒种类。来鉴定病毒种类。3. 特点：特点： 特异性高（这种抗血清是高度专一性的特异性高（这种抗血清是高度专一性的试剂），测定速度快，一般几小时甚至几分试剂），测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。鉴定中最有用的方法之一。三、电子显微镜检查法三、电子显微镜检查法F 病毒有一定的形态（病毒有一

21、定的形态（ 球状、杆状、线状等）球状、杆状、线状等）和大小（和大小（ 0.010.3um ）。）。F 采用电子显微镜（分辨率采用电子显微镜（分辨率0.0001um）可以直）可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，并鉴定病毒接观察病毒，检查出有无病毒存在，并鉴定病毒的种类。的种类。F 优点：灵敏度高，能在植物粗提取液中定量优点：灵敏度高，能在植物粗提取液中定量测定病毒。测定病毒。 第四节第四节 无病毒植物的利用无病毒植物的利用一、植物病毒的浸染与传播一、植物病毒的浸染与传播（一）浸染 植物自然孔口 植物细胞微伤 昆虫刺吸式口器（二）传播（二）传播 介体传播介体传播：昆虫、线虫、螨昆虫、线虫、螨 接

22、触传播：接触传播：自然接触（风、雨）、自然接触（风、雨）、 汁液接种（嫁接）汁液接种（嫁接） 人为活动（修剪）人为活动（修剪） 、 寄生植物（菟丝子）寄生植物（菟丝子） 种子（豆科）种子（豆科）二、无病毒苗的保存繁殖二、无病毒苗的保存繁殖 无病毒植株并不是有额外的抗病性，无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有可能很快又被重新感染。所以一旦它们有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无病毒苗，就应很好地隔离与保培育得到无病毒苗，就应很好地隔离与保存。存。这些这些原种或原种材料保管得好可以保原种或原种材料保管得好可以保存利用存利用510年。年。1、隔离保存：防虫网室、隔离保存：防虫网室2、长期保存

23、：、长期保存： 低温保存：培养基中，生长缓慢低温保存：培养基中，生长缓慢 超低温保存：液氮超低温保存：液氮 无病毒苗在生产中也要防止病毒的再感染。无病毒苗在生产中也要防止病毒的再感染。 生产场所应隔离病毒感染途径，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此种植区及种植规模小的地方，要较长时间才会感染。而在种植时间长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就可以感染。 三、无病毒苗的效果三、无病毒苗的效果 无病毒苗可以表现出明显的优良效果。无病毒苗可以表现出明显的优良效果。 如草莓可增产如草莓可增产2050，植株结果多，单，植株结果多，单果重增加，上等果比例提高。菊花切花品种的脱果重增加，上等果比例提高。菊花切花

24、品种的脱毒株，表现出株高增加，切花数增多，花朵大，毒株，表现出株高增加，切花数增多，花朵大，切花较重等特点。切花较重等特点。 以马铃薯试管苗或微型薯的萌芽以马铃薯试管苗或微型薯的萌芽为材料，在双筒解剖镜下剥取为材料，在双筒解剖镜下剥取0.2-0.2-0.5mm0.5mm带带1-21-2个叶原基的茎尖培养在诱个叶原基的茎尖培养在诱导培养基上。导培养基上。解剖镜下剥取茎尖并培养解剖镜下剥取茎尖并培养马铃薯马铃薯备用苗备用苗在培养的茎尖中选取转绿的茎尖转接到在培养的茎尖中选取转绿的茎尖转接到增殖培养基上作为病毒待检材料备用。增殖培养基上作为病毒待检材料备用。茎尖初代培养和继代培养茎尖初代培养和继代培

25、养 采用酶联血清免疫吸附反应鉴定采用酶联血清免疫吸附反应鉴定(ELISA(ELISA）鉴定由茎尖培养获得的试管苗是否带有马铃鉴定由茎尖培养获得的试管苗是否带有马铃薯主要病毒。确定无毒核心种苗。薯主要病毒。确定无毒核心种苗。 脱毒苗鉴定，确定核心种苗脱毒苗鉴定，确定核心种苗 经鉴定经鉴定脱毒的马铃薯试管苗脱毒的马铃薯试管苗，采用，采用固体、液体培养基相结合方法扩繁，要固体、液体培养基相结合方法扩繁，要求切段为求切段为1-21-2片叶的茎段，繁殖系数达到片叶的茎段，繁殖系数达到1 1：3 3，2525天继代一次。天继代一次。无病毒苗快速繁殖培养无病毒苗快速繁殖培养 将健壮的试管苗转到含将健壮的试管苗转到含8%8%糖浓度糖浓度的的MSMS培养基上，诱导试管薯，要求每培养基上，诱导试管薯，要求每株诱导株诱导1.51.5粒，每瓶达到粒，每瓶达到1010粒以上，粒以上，每粒不小于每粒不小于0.5g0.