多聚酶链式反应极好

1、1概念：概念：PCR即即_，是一种体外，是一种体外迅速扩增迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的片段的技术。它能以极少量的_为模板，在短时间内复制出上百万份的为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。拷贝。多聚酶链式反应多聚酶链式反应DNA 遗传疾病的诊断、遗传疾病的诊断、 刑侦破案、刑侦破案、 古生物学、古生物学、 基因克隆基因克隆 DNA DNA序列测定。序列测定。2 、PCR技术技术 的应用的应用 一、基础知识一、基础知识（一）回忆（一）回忆DNA的复制的复制 回答相关问回答相关问题题1、发生时间发生时间：发生在细胞有丝分裂的发生在细胞有丝分裂的间期间期和减数第一次分裂和减数第一次

2、分裂间期间期。2、特点特点(方式方式)：边解旋边复制边解旋边复制半保留复制半保留复制多起点复制多起点复制3、合成条件、合成条件模板模板：原料：原料：游离的脱氧核苷酸游离的脱氧核苷酸DNA两条链两条链能量：能量：ATP酶酶:解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶聚合酶反应条件温和反应条件温和4 4、场所：、场所： 细胞核细胞核(主主)、线粒体、叶绿体、线粒体、叶绿体DNA母链：提供复制的模板解旋酶：打开DNA双链4种脱氧核苷酸：合成子链的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链ATP：为复制过程提供能量引物：使DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸（二）（二）DNADNA复制的条件复制的条件12345脱氧

3、核苷酸结构脱氧核苷酸结构1DNA的平面结构：的平面结构：OOPOHO碱基碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖磷酸基团磷酸基团碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖53磷酸二酯键磷酸二酯键。脱氧核苷酸脱氧核苷酸 链链 结构结构目录上页下页习题参考书返回ATGCATGC5，端含磷酸基团端含磷酸基团3，端含羟基端含羟基3，端端5，端端目录上页下页习题参考书返回DNADNA聚合酶的特性聚合酶的特性 - 专一性专一性 DNA DNA聚合酶不能从头开始合聚合酶不能从头开始合成成DNADNA，而只能从，而只能从3 3端延伸端延伸DNADNA链。链。因此，因此，DNADNA复制

4、需要引物。复制需要引物。观察图观察图 2复制的方向：复制的方向：2 方向：方向：子链的子链的5端向端向 3端延伸。端延伸。 DNADNA双链双链单链单链 变性（加热变性（加热80-10080-100） 复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）变性的目的：变性的目的： 解开双链解开双链:解开氢键解开氢键 在80100 的温度范围内，的温度范围内，DNADNA的双螺旋结的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为构将解体，双链分开，这个过程称为2、PCR原理原理变性变性高温解决了打开双链的问题，但高温解决了打开双链的问题，但是，又导致是，又导致DNADNA聚合酶失活的问题，聚合酶失活的问题，耐高温的耐高温的

5、Taq DNATaq DNA聚合酶解决了高聚合酶解决了高温导致温导致DNADNA聚合酶失活的问题，促聚合酶失活的问题，促成了成了PCRPCR技术的自动化。技术的自动化。（2 2）、）、（3 3）、）、PCR PCR 反应的条件反应的条件DNADNA模板；模板；分别与两条模板链相结合的分别与两条模板链相结合的两种两种引物引物（引物（引物和引和引物物）；）；四种脱氧核苷酸；四种脱氧核苷酸；耐高温的聚合酶（耐高温的聚合酶（；控制温度，但控制温度，但不需解旋酶不需解旋酶；需要在一定的需要在一定的缓冲液缓冲液中进行。中进行。1234522557294时间（时间（minmin）温度（）适温延伸高温变性低温

6、复性重复13步30轮（1 1）、步骤：）、步骤：变性变性 复性复性延伸延伸二、二、PCR的反应过程的反应过程 5/3/3/5/5/3/引物引物5/3/引物引物变性变性95oC复性复性55oC延伸延伸72oC5/3/3/5/5 引物引物15 引物引物2第二次复制第二次复制第一次复制第一次复制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 三、三、 PCR反应的实验操作反应的实验操作三、三、 PCR反应的实验操作反应的实验操作（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备准备）（2）用）用微量移液器微量移液器按配方在微量按配方在微量离心管离心管中

7、依次加入各组分（中依次加入各组分（移液移液）（3）盖严）盖严离心管离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合混合）（4）将微量离心管放在）将微量离心管放在离心机离心机上（上（离心离心）（5）将离心管放入）将离心管放入PCR仪仪上，设置好上，设置好PCR仪的循环程序（仪的循环程序（反应反应）四、结果分析与评价四、结果分析与评价DNA 含量的测定：含量的测定：稀释稀释对照调零对照调零测定测定计算计算（ ）波长波长260nm处读数处读数蒸馏水蒸馏水做对照做对照50倍倍五、五、 课题延伸课题延伸例如：例如：PCRPCR产物每轮循环增加一倍，产物每轮循环增加一倍，3030轮循

8、环扩增量达轮循环扩增量达2 23030个拷贝（个拷贝（10109 9拷贝）拷贝）PCRPCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。外核酸扩增技术。 它具有它具有特异性强、特异性强、敏感性高、产率高、敏感性高、产率高、 快速、快速、 简便、重简便、重复性好、易自动化复性好、易自动化等突出特点。等突出特点。体内体内DNA复制与复制与PCR的技术区别：的技术区别：体内复制体内复制PCRPCR技术技术解旋解旋在解旋酶作用下，细在解旋酶作用下，细胞提供胞提供ATPATP，部分解开，部分解开加热到加热到9494o oC,C,双链全双链全部解开，不需解旋酶部解开，不需解旋酶引物引物一小段一小段RNARNA一般用一般用DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶细胞自身的细胞自身的DNADNA聚合酶聚合酶（不耐高温）（不耐高温）TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶复制特点复制特点半保留复制，边解旋半保留复