物理图谱与测序

1、第三章第三章DNA物理图谱的物理图谱的构建及序列测定构建及序列测定精选课件2物理图谱（物理图谱（physical map） 物理图物理图/限制性图谱（限制性图谱（restriction map）是各）是各种限制性内切酶切点在某一种限制性内切酶切点在某一DNA分子或分子或DNA片段片段上的排列，由于各酶切点之间的距离是以碱基对上的排列，由于各酶切点之间的距离是以碱基对（kbp mbp）表示的，所以可计算出二切点间）表示的，所以可计算出二切点间的绝对距离，因此限制图也称物理图。物理图谱的绝对距离，因此限制图也称物理图。物理图谱的构建是基因组研究的重要组成部分。的构建是基因组研究的重要组成部分。精选

2、课件3质粒质粒pBR322的限制图的限制图精选课件4一、限制性核酸内切酶（一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 细菌核酸内切酶细菌核酸内切酶识别、剪切特殊双链识别、剪切特殊双链DNA序列序列用途：用途：DNA物理图谱构建、物理图谱构建、DNA序列分析、基因序列分析、基因分离、基因定位、分离、基因定位、DNA重组重组精选课件51.细菌的细菌的 修饰作用和限制性核酸内修饰作用和限制性核酸内切酶的发现切酶的发现20世纪世纪50年代，年代，Luria &Human、Bertani &Weigle： 噬菌体噬菌体 细菌菌株细菌菌株1，正常生长。，正常生

3、长。 细菌菌株细菌菌株2，生长受到强烈抑制；少数存，生长受到强烈抑制；少数存 活，再次感染菌株活，再次感染菌株2，正常生长，正常生长受到受到 宿主的特意修饰。机制？宿主的特意修饰。机制？精选课件6E.coli 菌菌株株噬菌体感染率噬菌体感染率 K B CE.coli K110-410-4E.coli B10-4110-4E.coli C11111精选课件71962，Arber：宿主的修饰在噬菌体：宿主的修饰在噬菌体DNA上进行上进行1965，Arber：宿主对入侵噬菌体的修饰与：宿主对入侵噬菌体的修饰与噬菌体噬菌体DNA降解密切相关；预言细菌中存降解密切相关；预言细菌中存在位点特异性限制酶；修

4、饰是宿主甲基化在位点特异性限制酶；修饰是宿主甲基化酶作用结果：建立细菌限制酶作用结果：建立细菌限制-修饰（修饰（R-M）系统概念。系统概念。精选课件8Arber假说假说细菌中存在具有相同位点特异性的细菌中存在具有相同位点特异性的 2种酶种酶 ：限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶；甲基化酶甲基化酶细菌的限制细菌的限制-修饰系统是抵御外来侵袭的一修饰系统是抵御外来侵袭的一种重要措施种重要措施1978年诺贝尔生理学或医学奖年诺贝尔生理学或医学奖 精选课件9限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶的发现1968年，年，Linn & Arber于大肠杆菌于大肠杆菌B中发现第一种中发现第一种限制性内切

5、核酸酶（限制性内切核酸酶（I型：识别特异剪切随机）。型：识别特异剪切随机）。1968年，年，Meselson & Yuan从大肠杆菌从大肠杆菌K中获得高中获得高纯度限制性内切核酸酶（纯度限制性内切核酸酶（I型）。型）。1970年，年，Smith从流感嗜血杆菌从流感嗜血杆菌Rd中分离出第一种中分离出第一种II型限制性内切核酸酶型限制性内切核酸酶Hind II。精选课件10 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌 （Haemophilus influenzae）能迅速能迅速降解外源的噬菌体降解外源的噬菌体 DNA ，其细胞提取液可降解，其细胞提取液可降解 E.coli DNA ，但不能降解自身，但不能降

6、解自身 DNA ， Hind 限制性内切酶。限制性内切酶。 Hind 限制性内切酶位点和切限制性内切酶位点和切割位点如下：割位点如下： 5 GTPy PuAC 3 3 CAPu PyTG 5 精选课件11上世纪上世纪80年代，限制性内切酶开年代，限制性内切酶开始克隆表达始克隆表达精选课件12限制限制-修饰系统修饰系统精选课件13Smith等的工作等的工作流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌Rd与其它细菌相似与其它细菌相似DNA碱基化碱基化程程度低度低： m5C，N6-mA；但；但存在甲基化酶存在甲基化酶细胞粗提物细胞粗提物磷酸纤维素层析磷酸纤维素层析蛋白；蛋白； * S-腺苷腺苷甲硫氨酸转移甲基甲硫氨酸转

7、移甲基鱼精鱼精DNA/T7DNA。检检测出测出4种种腺嘌呤甲基化酶腺嘌呤甲基化酶其中一种处理其中一种处理T7DNA 免受免受Hind II裂解；先用裂解；先用Hind II处理鱼精处理鱼精DNA 对应甲基化位点破对应甲基化位点破坏。坏。限制性内切酶限制性内切酶-修饰性甲基化酶共识别修饰性甲基化酶共识别位点位点限制性内切酶识别位点处的甲基基团伸入到双螺限制性内切酶识别位点处的甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍了限制性内切酶的作用。旋的大沟中去，阻碍了限制性内切酶的作用。 精选课件14磷酸纤维素层析磷酸纤维素层析阳离子交换层析阳离子交换层析精选课件15氨基酸的等点点（氨基酸的等点点（isoele

8、ctric point，pI） 在一定的在一定的pH条件下，氨基酸分子中所带的正电条件下，氨基酸分子中所带的正电荷和负电荷数相等，即净电荷为零，此时溶液的荷和负电荷数相等，即净电荷为零，此时溶液的pH称为该氨基酸的称为该氨基酸的等电点等电点(isoelectric point, pI) 。 氨基氨基酸在等电点时溶解度最小。酸在等电点时溶解度最小。H3NCHCOOHRH3NCHCOOR-+ H+ OH-+ H+ OH-H2NCHCOOR-正离子正离子pHpI精选课件16离子交换层析分离子交换层析分离蛋白质离蛋白质精选课件17甲基转移酶催化甲基化（甲基转移酶催化甲基化（methylation）甲基

9、供体：甲基供体： S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸甲基受体：甲基受体：被修饰碱基（被修饰碱基（A、C多于多于G、T）碱基的甲基化修饰碱基的甲基化修饰不是随机的不是随机的，而是限于一定的顺，而是限于一定的顺序或序或DNA的某一区域，在的某一区域，在甲基化酶甲基化酶的作用下进行，的作用下进行，甲基化是甲基化是可逆的可逆的。甲基化的意义：甲基化的意义：帮助细胞识别和区分自身帮助细胞识别和区分自身DNA和外和外来来DNA；调节基因表达；帮助；调节基因表达；帮助DNA修复等。修复等。精选课件18腺苷转移酶腺苷转移酶PPi+Pi+甲硫氨酸甲硫氨酸ATPS-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸(S-腺苷腺苷Met，SAM)

10、S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸精选课件19甲基转移酶甲基转移酶RHRCH3腺苷腺苷SAMS腺苷同型腺苷同型半胱氨酸半胱氨酸同型半胱氨酸同型半胱氨酸SAM为体内甲基的直接供体为体内甲基的直接供体H2O精选课件20腺苷或胞嘧啶的甲基化是多种细菌的限腺苷或胞嘧啶的甲基化是多种细菌的限制修饰系统的一部份制修饰系统的一部份 精选课件21真核生物中也存在广泛的真核生物中也存在广泛的DNA甲基甲基化修饰现象化修饰现象 哺乳动物哺乳动物DNA的甲基化修饰和的甲基化修饰和X染色体失活、胚染色体失活、胚胎发育、组织分化乃至癌症密切相关。胎发育、组织分化乃至癌症密切相关。真核生物，修饰则影响基因表达。大多数情况下，真

11、核生物，修饰则影响基因表达。大多数情况下，甲基化修饰导致基因表达沉默。并且这种修饰在甲基化修饰导致基因表达沉默。并且这种修饰在细胞有丝分裂时可以代代传递细胞有丝分裂时可以代代传递新的遗传学分枝新的遗传学分枝-表观遗传学表观遗传学精选课件222. 限制性内切酶的种类与特性限制性内切酶的种类与特性限制性内切酶形式多样限制性内切酶形式多样 大小：大小：Pvu II（157个氨基酸）；个氨基酸）； Cje I （1250个个氨基酸）。氨基酸）。纯化分类的纯化分类的3000余种限制性内切酶，超过余种限制性内切酶，超过250种特种特异识别序列。异识别序列。研发工作仍在继续：分析细胞提取物，计算机分研发工作

12、仍在继续：分析细胞提取物，计算机分析已知基因组数据。析已知基因组数据。同裂酶（识别序列与已有的重复）；新识别位点同裂酶（识别序列与已有的重复）；新识别位点精选课件23 传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。然而，蛋白测序的结果表明，限制性内切酶的变然而，蛋白测序的结果表明，限制性内切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则应当远远化多种多样，若从分子水平上分类，则应当远远不止这三种。不止这三种。 精选课件24I型限制性内切酶型限制性内切酶 兼有限制性内切酶和修饰酶活性的

13、多亚基蛋白复兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋白复合体合体(3x105-4x105Da)，需，需Mg2+、ATP、SAM。在识别位点很远的地方任意切割在识别位点很远的地方任意切割DNA链：链：EcoB 识别位点识别位点TGA*（N）8TGCT ；EcoK 识别位识别位点点AAC（N）6GTGC （ A 为可能的甲基为可能的甲基化位点，化位点， N 表示任意碱基）表示任意碱基） 。切割位点在识别位。切割位点在识别位点点 1000bp 以外，且无特异性。以外，且无特异性。不产生确定的限制片段，不具备实用性。不产生确定的限制片段，不具备实用性。 精选课件25II型限制性内切酶型限制性内切酶种类多

14、（种类多（2x104-10 x104），需），需Mg2+激活激活绝大多数绝大多数酶识别序列酶识别序列/切割位点由切割位点由48个核苷酸个核苷酸多以同二聚体结合于多以同二聚体结合于DNA，识别对称序列，识别对称序列 ；极少作；极少作为单聚体结合到为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列上，识别非对称序列 。一些酶识别连续序列（一些酶识别连续序列（EcoR I：GAATTC）；另一）；另一些识别不连续序列（些识别不连续序列（Bgl I：GCCNNNNNGGC）。）。 切割后产生一个切割后产生一个3羟基端和一个羟基端和一个5磷酸基团磷酸基团 相应的修饰酶需要相应的修饰酶需要S-甲硫氨酸腺苷的存在甲硫氨

15、酸腺苷的存在精选课件26IIS型限制性内切酶型限制性内切酶 型具有相似的辅因子要求，但识别位点是型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ，切割位，切割位点可能在识别位点一侧的点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内（如范围内（如Fok I和和Alw I ）。）。 精选课件27III型限制性内切酶型限制性内切酶兼有限制兼有限制-修饰两种功能，需修饰两种功能，需Mg2+、ATP；当；当ATP、SAM同在时，同在时，DNA分解与甲基化同时进行分解与甲基化同时进行识别位点之外切开识别位点之外切开DNA链：链：EcoP1 和和 EcoP1

16、5 识识别位点分别是别位点分别是 AGACC 和和 CAGCAG ，切割位点，切割位点则在下游则在下游 24-26bp 处。处。很少能产生完全切割的片段，不具备实用价值。很少能产生完全切割的片段，不具备实用价值。精选课件28精选课件293.识别位点的序列测定识别位点的序列测定1970年，年，Smith建立：建立：碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase）T4多聚核苷酸激酶（多聚核苷酸激酶（T4 Polynucleotide Kinase ）胰腺脱氧核糖核酸酶（胰腺脱氧核糖核酸酶（DNase I）蛇毒磷酸二酯酶（蛇毒磷酸二酯酶（snake venom phosphodie

17、sterase ）电泳电泳精选课件30碱性磷酸酶碱性磷酸酶精选课件31T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 T4 多核苷酸激酶是一种磷酸化酶，可将多核苷酸激酶是一种磷酸化酶，可将 ATP 的的 g-磷酸基转移至磷酸基转移至 DNA 或或 RNA 的的 5 末端。末端。 精选课件32牛胰脱氧核糖核酸酶（牛胰脱氧核糖核酸酶（DNase I）P P P P P PPP嘧啶嘧啶 嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶 嘌呤嘌呤精选课件33蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶精选课件344.影响限制性内切酶活性的因素影响限制性内切酶活性的因素*DNA纯度纯度DNA制备过程中的污染：蛋白质、酚、氯仿、酒制备过程中的污染：蛋白质、酚、氯仿、

18、酒精、乙二胺四乙酸（精、乙二胺四乙酸（EDTA）、）、SDS（十二烷基硫（十二烷基硫酸钠）、高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸酸钠）、高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。内切限制酶的活性。对策：对策： 增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达可高达10单位甚至更多。单位甚至更多。 扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。被相应地稀释。 延长酶催化反应的保温时间。延长酶催化反应的保温时间。 精选课件35内切酶活力单位内切酶活力单位1U定义为定义为37、1h内完全分解内完全分解

19、1g -DNA所需的所需的酶量。酶量。 理论用量：理论用量： 1g -DNA只需只需1U酶作用酶作用1h；实际用；实际用量：量：2U，2h样品含酶抑制剂，重新纯化样品含酶抑制剂，重新纯化限量用酶限量用酶非特异性核酸酶活性非特异性核酸酶活性Dnase的污染（活性需的污染（活性需Mg 2+，DNA储存缓冲液含储存缓冲液含EDTA）精选课件36*DNA甲基化程度甲基化程度从大肠杆菌中分离的质粒从大肠杆菌中分离的质粒DNA通常混有：通常混有：dam甲甲基化酶，基化酶，G*ATC；dcm甲基化酶，甲基化酶，C*CA/TGG基因克隆中使用失去了甲基化酶的大肠杆菌菌株基因克隆中使用失去了甲基化酶的大肠杆菌菌

20、株制备质粒制备质粒DNA，避免被核酸内切限制酶局部消化，避免被核酸内切限制酶局部消化，甚至完全不被消化。甚至完全不被消化。核酸内切限制酶不切割甲基化的核苷酸序列的应核酸内切限制酶不切割甲基化的核苷酸序列的应用：甲基化酶的识别序列同某些限制酶的识别序用：甲基化酶的识别序列同某些限制酶的识别序列相邻，抑制在这些位点发生切割作用，改变核列相邻，抑制在这些位点发生切割作用，改变核酸内切限制酶识别序列的特异性；通过甲基化作酸内切限制酶识别序列的特异性；通过甲基化作用将内部的限制酶识别位点保护起来。用将内部的限制酶识别位点保护起来。 精选课件37*酶切消化反应的温度酶切消化反应的温度 大多数核酸内切限制酶

21、的标准反应温度都是大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37，但也有许多例外的情况，例如，但也有许多例外的情况，例如Sma是是25、Mae是是45。消化反应的温度低于或高。消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。甚至最终导致完全失活。 精选课件38*DNA的分子结构的分子结构 DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超螺旋有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒的质粒DNA或病毒或病毒DNA所需要的酶量，要比消化所需要的酶

22、量，要比消化线性线性DNA的高出许多倍，最高的可达的高出许多倍，最高的可达20倍。倍。此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。显的差别。 位点偏爱（位点偏爱（Site preference） 精选课件39位点偏爱（位点偏爱（Site preference） EcoR 酶切割酶切割 噬菌体中的噬菌体中的 5 个位点时不是随个位点时不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快 10 倍；倍； EcoR 和和 Hind 在在

23、噬菌体噬菌体 DNA 中的切割速中的切割速率分别有率分别有 10 倍和倍和 14 倍的差异。倍的差异。 噬菌体噬菌体 DNA 有有 4 个个 Sac 位点，三个在中央，位点，三个在中央，一个在右臂，对中央三个位点的酶切速度快一个在右臂，对中央三个位点的酶切速度快 50 倍。倍。 EcoR 对腺病毒对腺病毒 2DNA 不同位置切点的切割速不同位置切点的切割速率也不同。率也不同。 精选课件40*核酸内切限制酶的缓冲液核酸内切限制酶的缓冲液 核酸内切限制酶的标准缓冲液的组份包括氯化镁、核酸内切限制酶的标准缓冲液的组份包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、氯化钠或氯化钾、Tris-HCL、-巯基乙醇或二硫巯基乙

24、醇或二硫苏糖醇（苏糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（）以及牛血清白蛋白（BSA）等。）等。Mg2+的作用是提供二价的阳离子。缓冲液的作用是提供二价的阳离子。缓冲液Tris-HCL使反应混合物的使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。巯基试剂对于保持某些核酸佳数值的范围之内。巯基试剂对于保持某些核酸内切限制酶的稳定性是有用的，而且还可保护其内切限制酶的稳定性是有用的，而且还可保护其免于失活。免于失活。 精选课件41 不同的酶对离子强度的要求差异很大，并依次不同的酶对离子强度的要求差异很大，并依次将限制酶缓冲液按离子强度的差异分为高、中、将限制酶缓冲液按离子强

25、度的差异分为高、中、低三种类型，离子强度以低三种类型，离子强度以 NaCl 来满足，浓度分来满足，浓度分别为别为 100mM 、50mM 和和 0mM 。 精选课件42NEBuffer 1（黄色）：（黄色）：10 mM Bis Tris 丙烷丙烷-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT（pH 7.0 25）。）。NEBuffer 2（蓝色）：（蓝色）：10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT（pH 7.9 25）。）。NEBuffer 3（红色）：（红色）：50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100

26、mM NaCl, 1 mM DTT（pH 7.9 25）。）。NEBuffer 4（绿色）：（绿色）：20 mM Tris-Ac, 10 mM Mg(Ac)2, 50 mM KAc, 1 mM DTT（pH 7.9 25）。）。精选课件43宝生物公司缓冲液宝生物公司缓冲液精选课件44精选课件45 特殊缓冲液：特殊缓冲液： NEBuffer EcoRI：50 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 0.025% Triton X-100（pH 7.5 25）精选课件46双酶切缓冲液选择双酶切缓冲液选择精选课件475.星星活性（星星活性（star activi

27、ty） 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。 引起星星活性的因素：甘油浓度高（引起星星活性的因素：甘油浓度高（5%）；酶）；酶过量（过量（100U/ l）；离子强度低（）；离子强度低（8.0）；加入了有机溶剂如）；加入了有机溶剂如 二甲基二甲基亚砜、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲亚砜、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；用其它二价阳离子如酰胺等；用其它二价阳离子如 Mn2+ 、Cu2+、Co2+ 或或 Zn2+ 代替了代替了 Mg2+ 。不同的酶对上述条

28、件的敏。不同的酶对上述条件的敏感性不一样，如感性不一样，如 Pst 比比 EcoR 对高对高 pH 更敏感，更敏感，但后者对甘油浓度更敏感。但后者对甘油浓度更敏感。 精选课件48二、构建物理图谱的克隆载体二、构建物理图谱的克隆载体构建物理图谱的基本策略：将基因组构建物理图谱的基本策略：将基因组DNA片段与片段与载体整合进行克隆，获得重叠克隆群。载体整合进行克隆，获得重叠克隆群。载体的基本条件：自主复制原点，在宿主高效表载体的基本条件：自主复制原点，在宿主高效表达、稳定遗传；单克隆位点；筛选标记达、稳定遗传；单克隆位点；筛选标记精选课件49质粒载体质粒载体精选课件50精选课件51柯斯质粒柯斯质粒

29、黏粒（黏粒（cosmid）人工构建的含有人工构建的含有噬菌体噬菌体DNA的的cos序列和质粒复制子的载体。序列和质粒复制子的载体。cos 序列是序列是 噬菌体噬菌体 DNA 中将中将 DNA 包装到噬菌包装到噬菌体颗粒中所需的体颗粒中所需的 DNA 序列。序列。 1978年年Collins & Hohn等为克隆真核等为克隆真核DNA大片段大片段构建（质粒外源基因容量构建（质粒外源基因容量-10Kb）组成包括质粒复制起点（组成包括质粒复制起点（ColE1）、氨卡青霉素）、氨卡青霉素抗性标记、抗性标记、cos位点。位点。精选课件52精选课件53精选课件54黏粒的特点黏粒的特点具有具有噬菌体

30、的特性。黏粒在克隆了外源噬菌体的特性。黏粒在克隆了外源DNA在体在体外包装成噬菌体颗粒后，可以感染宿主菌并在细菌外包装成噬菌体颗粒后，可以感染宿主菌并在细菌内按照内按照噬菌体噬菌体DNA的方式环化起来。但黏粒载体的方式环化起来。但黏粒载体不含有不含有噬菌体的全部必要基因，因此不会使宿主菌噬菌体的全部必要基因，因此不会使宿主菌裂解，无法形成子代噬菌体颗粒。裂解，无法形成子代噬菌体颗粒。具有质粒的特性。黏粒具有质粒复制子，可在宿主具有质粒的特性。黏粒具有质粒复制子，可在宿主菌内像质粒菌内像质粒DNA一样进行复制。一样进行复制。克隆外源克隆外源DNA的容量大。黏粒自身相对较小，一般的容量大。黏粒自身

31、相对较小，一般只有只有57kb，而最大的克隆片段可达，而最大的克隆片段可达45 kb左右。左右。能与有同源序列的质粒进行重组。能与有同源序列的质粒进行重组。 精选课件55黏粒克隆的主要原理黏粒克隆的主要原理 类似类似 噬菌体载体。与外源片段连接时，粘粒载体相当于噬菌体载体。与外源片段连接时，粘粒载体相当于 噬菌体载体的左右臂，噬菌体载体的左右臂， cos 位点经粘端退火，与外源片位点经粘端退火，与外源片段相间连接成多联体。多联体与段相间连接成多联体。多联体与 噬菌体包装蛋白混合时，噬菌体包装蛋白混合时， 噬菌体噬菌体 A 基因蛋白的末端酶功能将切割两个基因蛋白的末端酶功能将切割两个 cos 位

32、点，位点，并将两个同方向并将两个同方向 cos 位点之间的片段包装到位点之间的片段包装到 噬菌体颗粒。噬菌体颗粒。这些噬菌体颗粒感染大肠杆菌时，线状重组这些噬菌体颗粒感染大肠杆菌时，线状重组 DNA 如如 噬噬菌体菌体 DNA 被注入细胞并通过被注入细胞并通过 cos 位点环化，形成完整粘位点环化，形成完整粘粒载体，可象质粒一样复制并使宿主获得抗药性。粒载体，可象质粒一样复制并使宿主获得抗药性。 与与 噬菌体载体不同，外源片段克隆在粘粒载体中以菌落噬菌体载体不同，外源片段克隆在粘粒载体中以菌落形式表现出来，非噬菌斑。这种菌落总和构成基因文库。形式表现出来，非噬菌斑。这种菌落总和构成基因文库。

33、上述带有外源片段的重组粘粒，可通过辅助上述带有外源片段的重组粘粒，可通过辅助 噬菌体感染噬菌体感染或诱导潜伏原噬菌体生长，重组粘粒的或诱导潜伏原噬菌体生长，重组粘粒的 cos 位点可作为包位点可作为包装的底物，导致重组粘粒装的底物，导致重组粘粒 DNA 被包装到噬菌体颗粒中去。被包装到噬菌体颗粒中去。这些转导性颗粒从细胞中释放出来，既可无限期贮存，也这些转导性颗粒从细胞中释放出来，既可无限期贮存，也可直接感染其他菌株。可直接感染其他菌株。 精选课件56精选课件57精选课件58酵母人工染色体酵母人工染色体（Yeast artificial chromosomes YAC）利用酿酒酵母（利用酿酒酵

34、母（Saccharomyces cerevisiae）的染）的染色体的复制元件构建的载体。色体的复制元件构建的载体。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为 90 分钟；含分钟；含 16 条染色体，其大小为条染色体，其大小为 225-1900kb ，总计有总计有14106 bp；具真核；具真核 mRNA 的加工活性。的加工活性。 精选课件59人工染色体必备结构元件人工染色体必备结构元件自主复制序列（自主复制序列（autonomously replication sequences，ARS） ：含有酵母菌中：含有酵母菌中 DNA 进行进行双向复制所必须

35、的信号双向复制所必须的信号 ；着丝粒（着丝粒（centromere，CEN）：负责染色体向）：负责染色体向子细胞的传递；子细胞的传递；端粒（端粒（telomere，TEL）：对染色体）：对染色体DNA末端末端起保护作用。起保护作用。精选课件60精选课件61精选课件62YAC 载体载体pYAC4 精选课件63YAC 载体的工作原理载体的工作原理 YAC 载体主要是用来构建大片段载体主要是用来构建大片段 DNA 文库（高等真核生文库（高等真核生物的基因组文库），不用作常规基因克隆。物的基因组文库），不用作常规基因克隆。 BamH 切割切割pYAC4形成微型酵母染色体，含染色体复形成微型酵母染色体，

36、含染色体复制必要顺式元件，可携带酵母染色体大小的制必要顺式元件，可携带酵母染色体大小的 DNA 片段。片段。 BamH切割后形成的微型酵母染色体，用切割后形成的微型酵母染色体，用 EcoR或或 Sma 切割抑制基因切割抑制基因 sup4 内部位点形成染色体的两条臂，内部位点形成染色体的两条臂，与外源大片段与外源大片段 DNA 相连形成大型人工酵母染色体，转化相连形成大型人工酵母染色体，转化进入酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到进入酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段子细胞中去，达到克隆大片段DNA 的目的。的目的。 装载外源装载外源 DNA 片段

37、的重组子导致抑制基因片段的重组子导致抑制基因 sup4 插入失活，插入失活，形成红色菌落；形成红色菌落； 载体自连形成白色菌落。装载不同外源载体自连形成白色菌落。装载不同外源 DNA 片段的红色重组酵母菌菌落的群体就构成片段的红色重组酵母菌菌落的群体就构成YAC 文库。文库。 YAC 文库装载的文库装载的 DNA 片段的大小一般可达片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达有的可达 1Mb 以上，甚至达到以上，甚至达到 2Mb 。精选课件64精选课件65精选课件66YAC 载体的缺陷载体的缺陷存在嵌合现象，即一个存在嵌合现象，即一个YAC克隆中插入子可能来克隆中插入子可能来自两个或多个不

38、同片段（嵌合克隆约占总克隆的自两个或多个不同片段（嵌合克隆约占总克隆的 5%50% ） 。YAC克隆稳定性差，插入片段会出现缺失克隆稳定性差，插入片段会出现缺失 （deletion） 和基因重（和基因重（rearrangement） 的现象。的现象。YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，染色体与宿主细胞的染色体大小相近， 插插入片段的分离、纯化较困难，转化效率亦较低。入片段的分离、纯化较困难，转化效率亦较低。精选课件67缺失和插入缺失和插入精选课件68重排（重排（rearrangement） DNA分子内较大分子内较大片段的交换片段的交换，称为重组，称为重组或重排。或重排。 精选课件69细

39、菌人工染色体（细菌人工染色体（BAC）基于大肠杆菌的基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。质粒载体。每个环状每个环状 DNA 分子中携带一个抗生素抗性标记，分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨因子（致育因子）的严谨型控制的复制子型控制的复制子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ），），一个易于一个易于 DNA 复制的由复制的由 ATP 驱动的解旋酶驱动的解旋酶（ （RepE） 以及三个确保低拷贝质粒精确分配以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座至子代细胞的基因座

40、（ parA , parB , 和和 parC ） 。 BAC 载体的容量载体的容量100-350Kb精选课件70F 质粒质粒 大肠杆菌的大肠杆菌的 F 因子是一个约因子是一个约 100kb 的质粒。的质粒。编码编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质（Willetts and Skurray，1987）。虽然）。虽然F因子通常因子通常以双链闭环以双链闭环DNA（1-2个拷贝个拷贝/细胞）的形式存在，细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进个位点处进行随机整合（行随机整合（Low，1987）。携带）。携

41、带F因子的细胞，因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的F菌毛。菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。所必需。 精选课件71精选课件72第一代第一代 BAC 载体载体 （Shizuya et al. 1992） 不含能不含能用于区分携带重组子的抗生素抗性细菌菌落与携用于区分携带重组子的抗生素抗性细菌菌落与携带空载体的细菌菌落的标记物。带空载体的细菌菌落的标记物。新型的新型的 BAC 载体可以通过载体可以通过互补的原理筛选含有互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆插入片段的重组子，

42、并设计了用于回收克隆 DNA 的的 Not 酶切位点和用于克隆酶切位点和用于克隆 DNA 测序的测序的 Sp6 启动子、启动子、 T7 启动子启动子 （Kim et al. 1996; Asakawa et al. 1997） 。 Not 识别序列，位点十分稀少。识别序列，位点十分稀少。重组子通过重组子通过 Not 消化后，可以得到完整的插入消化后，可以得到完整的插入片段。片段。 Sp6 、 T7 是来源于噬菌体的启动子，用是来源于噬菌体的启动子，用于插入片段末端测序。于插入片段末端测序。 精选课件73精选课件74BAC 载体空载时大小约载体空载时大小约 7.5kb ，在大肠杆菌中以，在大肠杆

43、菌中以质粒的形式复制，具有一个氯霉素抗性基因。质粒的形式复制，具有一个氯霉素抗性基因。外源基因组外源基因组 DNA 片段可以通过酶切、连接克隆片段可以通过酶切、连接克隆到到 BAC 载体多克隆位点上，通过电穿孔的方法载体多克隆位点上，通过电穿孔的方法将连接产物导入大肠杆菌重组缺陷型菌株。将连接产物导入大肠杆菌重组缺陷型菌株。装载外源装载外源 DNA 后的重组质粒通过氯霉素抗性和后的重组质粒通过氯霉素抗性和 Lac Z 基因的基因的 互补筛选。互补筛选。 精选课件75BAC载体的优点载体的优点以大肠杆菌为宿主，电转化，效率高以大肠杆菌为宿主，电转化，效率高BAC载体以超螺旋形式存在于大肠杆菌，提

44、取方载体以超螺旋形式存在于大肠杆菌，提取方便；便；复制子源自复制子源自F质粒，遗传稳定，嵌合、重组少；质粒，遗传稳定，嵌合、重组少；DNA单拷贝存在，适于传统菌落培养，可采用菌单拷贝存在，适于传统菌落培养，可采用菌落原位杂交筛选目地基因；落原位杂交筛选目地基因；克隆位点两侧有克隆位点两侧有T7和和SP6启动子，可制备启动子，可制备RNA探探针或对插入片段测序。针或对插入片段测序。精选课件76菌落原位杂交筛菌落原位杂交筛选目地基因选目地基因精选课件77E.coli RNA聚合酶的结构聚合酶的结构E.coli只有一种只有一种RNA聚合酶聚合酶 全酶（全酶（holoenzyme） : 2 ( 450

45、 kD ) 核心酶（核心酶（core enzyme）：）：2 精选课件78大肠杆菌大肠杆菌RNA聚合酶全酶识别并结合于启动子聚合酶全酶识别并结合于启动子精选课件79精选课件80精选课件81三、基因组研究的有关图谱三、基因组研究的有关图谱遗传图谱遗传图谱物理图谱物理图谱基因图谱基因图谱序列图谱序列图谱精选课件82精选课件83精选课件841.遗传图谱（遗传图谱（genetic map）/遗传连锁图遗传连锁图/连锁连锁图谱（图谱（linkage map）以具有遗传多态性（在一个遗传位点上具一个以以具有遗传多态性（在一个遗传位点上具一个以上的等位基因，在群体中的出现频率皆高于上的等位基因，在群体中的出

46、现频率皆高于1%）的遗传标记为的遗传标记为“路标路标”，以遗传学距离（在减数，以遗传学距离（在减数分裂事件中两个位点之间进行交换、重组的百分分裂事件中两个位点之间进行交换、重组的百分率，率，1%的重组率称为的重组率称为1cM）为图距的基因组图。）为图距的基因组图。6000多个遗传标记将人的基因组分成多个遗传标记将人的基因组分成6000多个区多个区域，使连锁分析法可以找到某一致病或表现型的域，使连锁分析法可以找到某一致病或表现型的基因与某一标记邻近（紧密连锁）而定位。是定基因与某一标记邻近（紧密连锁）而定位。是定位疾病基因和分析基因是个关键。位疾病基因和分析基因是个关键。精选课件85遗传图遗传图

47、基因定位基因定位精选课件86遗传图谱的遗传图谱的 DNA标记标记 第第1代标记：代标记：经典的遗传标记，以蛋白质或免疫学经典的遗传标记，以蛋白质或免疫学多态性位点为标记。多态性位点为标记。标记位点与所研究性状标记位点与所研究性状间连锁关系。间连锁关系。ABO血型位点标记，血型位点标记，HLA（人类白细胞抗原）位（人类白细胞抗原）位点标记。点标记。已知多态性蛋白位点少，技术复杂、已知多态性蛋白位点少，技术复杂、准确性差。准确性差。70年代，限制性片段长度多态性（年代，限制性片段长度多态性（RFLP）：群）：群体中不同个体体中不同个体DNA序列仅有约序列仅有约1%差异差异DNA多态性位点，酶切位点

48、的变异多态性位点，酶切位点的变异（RFLP）。）。精选课件87限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性精选课件88精选课件89第第2代标记代标记 80年代，微卫星中心（年代，微卫星中心（minisatellite core）、可变）、可变串联重复串联重复VNTR（variable number of tandem repeats）提供不同长度重复片段（）提供不同长度重复片段（612个核苷个核苷酸酸 1989年年微卫星标记微卫星标记（microsatellite marker）系统的发现和建立，结合系统的发现和建立，结合PCR技术技术简单序列简单序列长度多态性（长度多态性（simple sequ

49、ence length polymorphism，SSLP） ，扩增片段长度多态性，扩增片段长度多态性 (Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）等）等 。精选课件90微卫星（微卫星（microsatellite）标记）标记微卫星又称为简单重复序列（微卫星又称为简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）。）。这种重复序列的重复单位很短，常常只有这种重复序列的重复单位很短，常常只有2个、个、3个或个或4个核苷酸个核苷酸如一条染色体如一条染色体TCTGAGAGAGACGC另一染色另一染色TCTGAGAGAGAGAGAGAGA

50、CGC，就构成了多态性。就构成了多态性。精选课件91精选课件92第第3代标记代标记 90年代，单核苷酸多态性年代，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)：指染色体基因组水平上由：指染色体基因组水平上由单个核苷酸变异引起的单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，具有分序列多态性，具有分布广、密度高（人类基因组中每布广、密度高（人类基因组中每1000个核苷酸就个核苷酸就有一个有一个SNP ）、多态性丰富等特点。）、多态性丰富等特点。 精选课件93精选课件94果果蝇蝇连连锁锁图图精选课件9514号染色体遗传图谱上家系定位示意图号染色体遗传图谱上家系定位示

51、意图 精选课件967号染色体上已定位的遗传病号染色体上已定位的遗传病 精选课件97疾病基因的确定疾病基因的确定 精选课件982. 物理图谱物理图谱基因组基因组DNA限制性酶切片段排列顺序图限制性酶切片段排列顺序图酶切片段在酶切片段在DNA链上的定位链上的定位基因组中基因间顺序显性化基因组中基因间顺序显性化比遗传图谱分辨率更高比遗传图谱分辨率更高是从遗传图到序列图的中间图谱是从遗传图到序列图的中间图谱精选课件99精选课件100 核苷酸序列不同的核苷酸序列不同的DNA，经酶切后产生不同长，经酶切后产生不同长度的度的DNA片段，由此构成独特的酶切图谱。片段，由此构成独特的酶切图谱。 精选课件1013

52、. 序列图谱序列图谱 包括制备包括制备DNA片段化及碱基分析、片段化及碱基分析、DNA信息翻译的信息翻译的多阶段的过程。通过测序得到基因组的序列图谱。多阶段的过程。通过测序得到基因组的序列图谱。 大规模测序基本策略大规模测序基本策略: 逐个克隆法逐个克隆法：对连续克隆系中排定的：对连续克隆系中排定的BAC克隆逐个克隆逐个进行亚克隆测序并进行组装（公共领域测序计划）。进行亚克隆测序并进行组装（公共领域测序计划）。 全基因组鸟枪法全基因组鸟枪法：在一定作图信息基础上，不经大：在一定作图信息基础上，不经大片段连续克隆系的构建，直接将基因组分解成小片段片段连续克隆系的构建，直接将基因组分解成小片段随机

53、测序，利用超级计算机进行组装（美国随机测序，利用超级计算机进行组装（美国Celera公公司）。司）。 精选课件102逐个克隆法逐个克隆法鸟枪法鸟枪法精选课件1034.基因图谱基因图谱 在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。鉴别出全部基因的位置、结构与功能，息的图谱。鉴别出全部基因的位置、结构与功能，最主要的方法是通过基因的表达产物最主要的方法是通过基因的表达产物mRNA反追反追到染色体的位置。到染色体的位置。能有效地反应在正常或受控条件中表达的全基因能有效

54、地反应在正常或受控条件中表达的全基因组时空图。组时空图。 可以了解某一基因在不同时间不同组织、不同水可以了解某一基因在不同时间不同组织、不同水平的表达；也可以了解一种组织中不同时间、不平的表达；也可以了解一种组织中不同时间、不同基因中不同水平的表达，还可以了解某一特定同基因中不同水平的表达，还可以了解某一特定时间、不同组织中的不同基因不同水平的表达。时间、不同组织中的不同基因不同水平的表达。 精选课件104 对基因转录表达产物对基因转录表达产物mRNA互补的互补的cDNA（其片段称为表（其片段称为表达序列标签，达序列标签，EST）进行大规模测序是序列标签位点的主）进行大规模测序是序列标签位点的

55、主要来源，并以此构建人类基因组转录图（基因图）。要来源，并以此构建人类基因组转录图（基因图）。精选课件105A portion of the E.coli chromosome showing genes and operons. A dot indicates the promoter for each gene or operon. Arrows and color indicate the direction of transcribtion: dark blue genes are transcribed left to right, light blue are transcribe

56、d right to left.Overlapping gene are shown in green.精选课件106四、构建四、构建DNA物理图谱的方法物理图谱的方法完整的物理图谱包括：人类基因组的不同载体完整的物理图谱包括：人类基因组的不同载体DNA克隆片段重叠群图；大片段限制性内切酶切克隆片段重叠群图；大片段限制性内切酶切点图；点图；DNA片段或异片段或异DNA序列（序列（sequence tags site，STS）的路标图；基因组中广泛存在的特征）的路标图；基因组中广泛存在的特征型序列（如型序列（如CpG序列、序列、Alu序列，序列，isochore）等的）等的标记图。标记图。基本原

57、理是把庞大的无从下手的基本原理是把庞大的无从下手的DNA先先“敲碎敲碎”，再拼接。以再拼接。以Mb、kb、bp作为图距，以作为图距，以DNA探针探针的的STS（sequence tags site）序列为路标。）序列为路标。 精选课件107主要方法主要方法限制性核酸内切酶降解法限制性核酸内切酶降解法部分变性法部分变性法DNA聚合酶法聚合酶法杂交电镜法（环形成法）杂交电镜法（环形成法）末端标记法末端标记法精选课件1081.限制性核酸内切酶降解法限制性核酸内切酶降解法部分酶解法部分酶解法交叉酶解法交叉酶解法精选课件109部分酶解法的部分酶解法的2个基本步骤个基本步骤完全降解：完全降解：限制性内切酶

58、将放射性标记限制性内切酶将放射性标记DNA完全完全降解，经凝胶电泳分离后进行自显影，图谱显示降解，经凝胶电泳分离后进行自显影，图谱显示组成该组成该DNA链的酶切片段的数目和大小。链的酶切片段的数目和大小。部分降解：部分降解：末端标记末端标记DNA一条链，以相同酶部分一条链，以相同酶部分降解（控制反应条件使降解（控制反应条件使酶量、温度、时间酶量、温度、时间DNA链上该酶的切口随机断裂），电泳分离及自链上该酶的切口随机断裂），电泳分离及自显影。比较显影。比较2个自显影图谱，根据片段大小及彼此个自显影图谱，根据片段大小及彼此间的差异排出酶切片段在间的差异排出酶切片段在DNA链上的位置链上的位置片片

59、那段重叠。那段重叠。精选课件110 一线性一线性DNA片断长片断长18.1kb，EcoRI完全消化后电完全消化后电泳，得泳，得8个片段，部分消化产生个片段，部分消化产生15个片断。个片断。完全消化片断：完全消化片断： A (4.6) , B (4.0), C (3.3), D (2.5), E (2.0), F (1.0), G (0.5), H (0.2)部分消化片断部分消化片断: 6.6 6.5 5.3 4.6 4.2 4.0 3.8 3.5 3.3 2.5 2.0 1.0 0.7 0.5 0.2精选课件111部分消化大片断是完全消化小片断之和，可推测：部分消化大片断是完全消化小片断之和，

60、可推测：6.6 = 2+4.6（E + A）；）； 6.5 = 2.5+4.0 （D + B）；5.3 = 2+3.3（E + C）； 3.8 = 0.5+3.3（G + C）；0.7 = 0.2+0.5（G+H）；4.2 = 0.2+4 （B+H） 或或 4.2 =0.2+0.5+1.0+2.5（H + F + G + D）；3.5 =1.02.5 （F + D） 或或 3.5 = 0.2+3.3（H + C） 或或 3.5 = 0.5+1.0+2.0（G + F + E）A E C G H F D B4.6 2.0 3.3 2.5 4.00.5 0.2 1.0EcoR I 在此在此DNA片段片段上的酶切图谱上的酶切图谱精选课件113交叉酶解