实验蛋白质标准曲线的制作

1、学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beers law）。此染料与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残结合，通过测定595nm吸光度可测定蛋白质的含量。另外，反应体系中呈现的颜色变化主要是G-250分子间疏水

2、相互作用形成的聚集体聚集程度不同引起的。单体形式表现为蓝色，单体和聚集体共存时表现为绿色，全为聚集体形式呈现为棕红色。影响因素主要为溶液体系中磷酸、乙醇、NaCl的含量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质染料复合物发生聚合并沉淀出来。（一）试剂1. 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G250 100mg溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。2. 标准蛋白质溶液：纯的牛血清

3、血蛋白(BSA)，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。（二）器材721型分光光度计、移液管（1mL，5mL）、试管及试管架试管编号0123451mg/mL标准蛋白（mL）00.20.40.60.810.15mol/L NaCl （mL）10.80.60.40.20考马斯亮蓝试剂 （mL）555555充分摇匀，20min内以0号管为空白对照,在595nm测定A595nm以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为200g、400 g、600g、800 g、1000 g），在坐标轴上绘制标准曲线。1. 利用标准曲线查出回

4、归方程。2. 用Excel作图，测出回归线性方程。即A595nm=aX。相关系数一般大于0.9。3. 未知样品蛋白质浓度的测定：测定方法同上，取合适体积的未知样品(奶粉，1g奶粉溶于30mL 0.15mol/L NaCl，3000rpm离心5分钟，取上清待用 )，使其测定值在标准曲线的直线范围内（01000g），根据所测定的A595nm，利用标准曲线或回归方程求出相当于标准蛋白质的量（g），从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。一般被测样品的A595nm值在0.10.5之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以减少取样量，如果仍然很大，可以定量稀释后再进行测定。（一）蛋白质与考马斯

5、亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内基本稳定。如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的520min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。（二）测定中，蛋白染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。1Bradford法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。2有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。3测定时仅使用一套比色杯（2个），并从低浓度到高浓度依次测定。中间不要用蒸馏水润洗比色杯，仅用待测液润洗23次即可。另外，还要注意，玻璃仪器要