真菌学实验报告(20210802123057)

1、真菌学实验报告一. 实验目的：1.1 了解真菌形态的基本特征。1.2掌握丝状真菌制片方法。1.3掌握内生真菌的分离方法1.4掌握真菌的签定方法。二. 前言：真菌广泛分布于地球表面，从髙山、湖泊到田野、森林，从 海洋、髙空到赤道、两极，到处都有真菌。真菌虽然不在空气中生长 繁殖，但它的花子却成群的漂浮在天空，只要稍微注意你会发现人类 原来生活在真菌的汪洋大海中:.当今世界，生物技术已迈入世界经济的支柱产业，真菌学 在生物技术的大潮中得到了长足的发展。真菌是原始的真核生物，具 有广泛的多样性，真菌生长我繁殖迅速，在很短的时间内就可以得到 比动物和植物多得多的后代，能够直接、快速地进行遗传性状分离的

2、 分析。因此，真菌可以作为研究基础生物学过程中的一个重要工具， 真菌基因的多样性以及真菌分亍生物学的发展，为生物技术产业提供 了一个广阔的天地。植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物 种的年代越久远，其生物内生真菌的多样性越丰富：抗病原性能越强 的植物，其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；其所含的 内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌活性 物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和 G+、G-细菌的抑制实验发现茎，根，花，种亍或果实内生真菌的代 谢产物具有不同程度的抑菌能力，并且对G+、G-有普片遍的抑菌作 用。研究和开发内生真菌的寻找新的

3、抗菌活性物质具有广泛的应用前 景。三. 材料与方法：3.1.1材料：在校园内釆集银杏、喜树、桂花树样品包括叶、茎、 根、花、种亍或果实。3.12药品与试剂：葡萄糖、蛋白腺、KH2P04 3H2O、MgSO4 7H2O, 马铃薯、琼脂。盂加拉红，青霉素，链霉素，甲基蓝，雀白腺，酵母 膏，蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。消毒剂：75%的乙 醇，（）.1%升汞（HgCI2）,次氯酸钠溶液（含活性氯10%）, 30%双氧水。 双蒸水、琼脂糖，Tris饱和酚、痴基乙醇（p- Mcrcaprotthanol）,石英砂, T*饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯化钠，盐 酸，氢氧化钠，E

4、DTA, CTABo3.1.3.培养基：3丄3.1马铃薯、葡萄糖琼脂培养基马铃薯汁1000ml,葡萄糖20g,琼脂20g（注：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1（）0（）毫升煮 沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡 萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，15磅灭菌30分钟察氏琼脂培养基蔗糖 30g, NaNO3 3g, MgSO4.7H2O 0.5g KC10.5g,FCSO4.7H2O O.Olg, K2HPO4 Ig,琼脂 13g,蒸储水 1000ml,自然 pH沙氏培养基蛋白腺Ig,葡萄糖或麦芽糖4g,琼脂1.5克，水100mL制法：1将

5、上述物质称好，放入水中煮沸溶解（不必调PH 即有5左右）分中号试管（约4毫升）包扎，髙压1l5C20分钟。趁 热斜好，凝固宙用。3.13.4马丁氏培养基葡萄糖 10g,蛋白腺 5g, KH2PO4lg, MgSO4*7H2O 0.5g,1%孟加拉红3.3mL,琼脂20g,水1(X)()mL, pH值自然。抗生素用法与用量：培养基灭菌之后分装前按链霉素 4()U/mL,青霉素3()U/mL用量加入，冷却到45C左右未凝固时加入 抗生素，混匀倒平板。四. 方法：4.1.1采样方法：在校园内找到银杏、喜树、桂花树并用刀釆集叶、茎、根、皮、种子。分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。老树皮用

6、75%酒精进行表面消毒后，用镣子取出，于 酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1 Xlcm2大小置于PDA固体培 养基上。对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒：75%的酒精漂(浸)洗2-3min一无菌水冲洗4-6次-0.1%升汞不同的 消毒时间(见表2-2,共设置7个梯度)一无菌水冲洗4-6次一用灭 菌滤纸吸干多余水分一无菌刀片将材料切成小块将根、茎的表皮、韧 皮部、木质部大致分开，并切成0-5X 0.5cm2大小。将果实的外种皮去掉，消毒*后将内种皮去掉灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间, 倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶 液充分接触，驱除气泡，使消

7、毒彻底。在快到时间之前12分钟，开 始把消毒液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立 即倒入无菌水，轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无 菌水时为止。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液，切勿勉强 在一个体积偏小的容器中使用很多材米斗灭菌。4.13内生菌的分离方法：将上述组织块置于分离培养基上（每一平皿培养 5块组织块）于27C恒温培养，同时将上述消毒过程中最后一次冲洗 组织块后的无菌水滴在培养基上平行培养，用以检测消毒是否彻底。 观察菌丝生长情况及污染情况。4.1.4纯化方法：培养3-4天后及时采用尖端菌丝挑取法，挑取形 态不同的菌丝或菌落移种到新鲜PDA培养基上。纯

8、化3-4次以保证 所得菌落为纯培养。4.2形态鉴定方法：4.2.1培养方法：培养基：査氏培养基、沙氏培养基和PDA培养基。将4C保存菌种活化2次；421.3将活化菌种分别点种PDA、沙氏、察氏平板，每重复25 C恒温培养箱培养7天；421.5然后进行菌落特征描述，取一个平行进行制片（胶带亍 粘片法），观察个体形态；另两个平行继续培养至14天，取岀；421.7重复步骤4,作为最终描述结果；421.8根据真菌分类鉴定手册和相关资料分析确该菌的归属。422制片方法：胶带粘贴法：选用在显微镜油镜下观察细致不粗糙且粘性好的 胶带。取一小段胶带从菌落

9、表面的中心向边缘粘，75%乙醇固定，乳 酸石炭酸棉蓝染色液染色，将粘有菌丝的一面向上，盖上盖玻片，于 显微镜下观察产袍结构等特征。423鉴定标准：观察的要点：4.2.4菌落宏观形态：大小：以菌落的直径（mm）表示。颜色：包括菌落表面和背面的颜色，及色素是否渗入培养基。菌落表面的纹饰：如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或 疏松等。菌落的质地：毡状、毯状、绒毛状、棉絮状、粉粒状、革质状、 有无成束状或绳状的气生菌丝O菌落的高度：扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分状况等。菌落边缘：全缘、锯齿状、树枝状等。泮出物：菌落表面有无液滴及液滴的颜色等。4.2.5个体形态：菌丝的特征：表面性状（粗糙或光滑）

10、，宽度等分生袍子梗：分支情况-简单或复杂，轮生或单生等；长短；基 部粗糙或光滑等。产袍结构的形态特征：形状，大小，着生状况（位置，单生、互 生或成轮生体）分生袍子的形态：形状，大小，表面状况，聚集方式（直链、斜 链或聚集成头）4.3分子生物学鉴定：4.3.1培养方法：培养基成分与不加琼脂的PDA固体培养基成分相同。将液体 培养基以100mL每瓶分装至25（）m L三角瓶中，用8层纱布封口。121 C , 蒸汽灭菌20mino将菌丝致密的真菌接种到液体培养基中，于恒温振荡培养箱中27C、 l2Orpm培养5-7天。用两层灭菌纱布过滤菌丝球，用无菌蒸陶水冲洗菌丝球5 次，避免培养基中的糖类和雷白对

11、DNA提取的影响。40C下烘干菌丝，但是不 要过于干燥，然后进行DNA的提取。4.3.2基因组DNA的提取DNA 提取采用 CT AB 法。CTAB (cetyltriethylammonium bromide,十六烷基三乙甚漠化铉)是一种去污剂，可溶解细胞膜， 它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的，当降低溶液盐浓度 到一定程度时，从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与核酸的复台物 同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解 于髙盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。CTAB法 的好处是能很好地去掉糖类杂质，提取前期可得到髙含量的DNA。4.321用CTAB

12、法提取材料DNA的具体步骤如下：将CTAB buffer在65C水浴锅中预热，研钵用液氮预冷；4.322取(11 g左右菌丝体，在液氮中迅速研磨成粉末后，迅速加入 5mL预热的提取液及1()卩L3-痴基乙醇，混合均匀后把混合液转入 1.5mL离心管中70()卩L/管；4.323于65C水浴保温0.5-1 h，时间不能超过1.52保温期间要轻轻 振摇几次；4.324冷却至室温后，加入等体积。00叫)的饱和酚：氯仿:异戊醇(25: 24： 1),充分混匀后静置lOmiiio4.325离心(120()()rpm, lOmin,室温)，去沉淀，将上清液转入干净离 心管中。4.326根据杂质的去除情况重

13、复步骤4、5数次，直至无杂质；4.327加入等体积氯仿：异戊醇(24: 1)抽提一次以去除饱和酚，离心 (12000rpm, lOmin,室温)；4.328将上清液逐滴加入两倍体积的-20C预冷无水乙醇，以沉淀岀DNA。室温放置10-20min,可以过夜；4.329挑取或离心去上清液(10000 rpm, 5min)的方法取出DNA;用75%乙醇洗涤两次； 37t保温箱中干燥后溶于适星的TE缓冲液中4C宙用。4.4所用引物ITS5: GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC4.4.1PCR反应条件：441.1体系:PCR反应体系为5()卩

14、L体系，包括：10XPCR buffer：1/10MgCl2 :1.5mM,dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP):各 200卩M,Primerl().2卩M,Primcr20.2卩M,Taq 酶：1 2.5U,DNA模板：4.4.2条件：扩增条件约 1OOngo预变性 95C5min变性95CImi 1复性51 C.Imii3035个循环延伸72CImin延伸补齐72ClOmin443测序方法：送测序公司。4.4.4序例分析：五.结果及分析：结果：试验分离到两种真菌5.1丿UK整分离到菌种査氏正反照5.1.1菌落宏观形态：大小：菌落的直径3.2 (mm)。颜色：包括菌落表面棕

15、黑色背面灰色，色素渗入培养基。菌落表面的纹饰：如皱纹、整个菌落致密。菌落的质地：毡状菌落的高度：凸起或隆起。菌落边缘：锯齿状。渗出物：菌落表面无液滴。5.1.2个体形态：菌丝的特征：表面粗糙。分生袍子梗：分支复杂，轮生。5.1.3分亍生物学鉴定通过PCR扩增和序列分析，送公司检测得到的序列为：TGAAGTTAAAAAGCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGG ATCATTACAAGTGACCCCGGTCTAACCACCGGGATGTTCATAACCCTTT GTTGTCCGACTCTGTFGCCTCCGGGGCGACCCTGCC1TCGGGCGGGGG CrCCG

16、GGTGGACACTTCAAACTCTTCiCGTAACTTTGCACiTCTGAGTAAACTrAATrAATAAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTrGGTrCTGGCAT CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATT CAGTGAATCATCGAATCTrrGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCG GGGGGCATGCCTGTFCGAGCGTCATTTCACCACTCAAGCCTCBTTGGTATTGGGCATCGCGGTCCGCCGCGTGCCTCAAATCGACCGGCTGGGTCTTCTGTCCC

17、CTAAGCGTTGTGGAAACTATTCGCTAAAGGGTGTTCGGGAGGCTACGCCGTAAAACAACCCCATITCTAAGGTrGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTrAAGCATATCAAAATCGGAGGAA诵过blast序列分析得到的结果为：Distribution of 100 Blast Hits on the Query Sequencecoor trSequences producing significant alignments：Y102I0K1岐WX3i3I0J3倾13%95%98%炽99%10X3WJ310 J3倾1噸1#3

18、JOCot0(GtfK arJmw%98%Of%已nm GQ4 知咳 30“跳站HOU% 2UZ2HZ11皿 1LJWL1必a mm19% GUKM q93%10B10Bex g g g331倾99%C(Uncultured fungus done L046937-122-075-C01-unis 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and Internal transcribed spacer 2, complete sequence

19、; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequenceGenBank JF2891171FASTA OEM B 彩:L0CU3MFiwrricNACCES5I0C1 RS 1013 KEYWCMS S：E CRoAX：XSREFERENCE ACTHCRSTITLEJOURNALREFZREKCEJLUTHCR5TITLEJF25911?632 bp MCl lineax ET7 M-CV-20iiOncultured fungus clone L046i37-l?-075-C01-unxs 1Q9 ribasdm1 RH& gener partial s

20、equence; xnt.ernal transzrikc spazez lr 5.83 riboseruil RNA gener and internal transcribed spa-er 2, camplere seTocnce; ana 28S riccsoroi MA gene, partial sequence.JF2B9117JF259117,1 GI：354 72即 4EFV.uncult uxe 1皿EvMxyste;eavirsxatenxal sa&ples.1 Chases 1 ta 602Frahli*h-Nevai.3in% J., aurrsws.S.X., X

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