肝细胞原代培养实验方案

1、原代培育肝细胞是肝细胞移植、生物人工肝的最佳生物材料。长期以来, 国内外众多学者对肝细胞分别方法 、培育条件进行了大量的争辩 , 但要获得高活率、功能好的肝细胞,至今仍非易事。早期主要用非酶法分别肝细胞 ,包括机械法( 如匀浆法) 及螯合法。机械法对肝细胞损伤大, 细胞活率低; 螯合法是用可结合 Ca2+ 、M g2 +的螯合剂(如枸橼酸盐或 EDTA) 分别肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好 ,常需与酶法结合使用。后期渐渐改为酶消化法分别肝细胞 ,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法 。后者对酶浓度及作用时间要求格外严格, 且由于胰蛋白酶是一种强蛋白质消化酶, 对肝细胞膜破坏严峻 , 因而易造成肝

2、细胞死亡 , 导致分别失败。胶原酶消化法对肝细胞损伤较小 , 虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害, 但经培育后可完全修复 。胶原酶在消化肝的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体, 使肝细胞能渐渐适应消化分别过程中所发生的细胞内 、外环境及细胞间的各种转变 。这些转变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要的促进作用 ,有利于肝细胞的培育。这种适应性转变恰恰是机械分别法所没有的。因此 ,要猎取抱负的肝细胞,酶消化这一重要环节不行缺少。Seglen 二步灌注法为经典的胶原酶消化法,但所需设备较简单 ,胶原酶消耗量大 。本争辩在其基础上略加改进。作者认为 ,接受胶原酶消化法

3、,胶原酶的用量、作用时间及作用条件是分别成功与否的关键 。胶原酶的浓度过高 ,作用时间难以把握 ; 浓度过低 ,则作用时间过长、细胞活率降低。事先用无Ca2 +、M g2+的灌注液进行预灌注, 去除 Ca2+依靠性粘附因子 ,使桥粒断裂; 然后用含 Ca2+的胶原酶消化 ,胶原酶的作用需要 Ca2+的活化 , 在 5 mmol/LCa2 +浓度下 ,用浓度为 500 mg/ L 的胶原酶 37 条件下消化 15 min 最佳。在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时 ,温度需保持在 0 4 。肝细胞分别时, pH 值宜维持在 7 . 4 左右, 不低于 7 . 2 ,最高不超过 7 . 6 ,

4、 否则将对肝细胞造成很大损伤。在肝灌注液中加入适量的小牛血清或者牛血清白蛋白,可以维持细胞代谢和液体渗透压, 提高肝细胞成活率 。此外,门静脉插管应快速置入,灌注速度必需保持全都。培育板预处理及培育液选择 接受铺过胶原的新培育板与没有铺过胶原的新培育板 ,铺过胶原的老培育板培育肝细胞比较 , 发觉肝细胞在铺过胶原的新培育板中长势更好 。新的培育板使用 Sigm a公司供应的胶原铺胶 ,置于 37恒温箱中过夜后使用。过去选择含 8%胎牛血清的 W E作培育基 ,效果不错 , 但 WE价格昂贵 ,我们试着接受含 10%胎牛血清的 RPM 1640培育基 , 并在其中加入胰岛素 , 地塞米松等生长因

5、子 , 肝细胞生长好 。肝细胞的接种密度对其以后的生长状况有很大的影响 : 密度太小 ,细胞不易生长 ; 密度太大 , 肝细胞增殖受到抑制 , 培育板中缺少足够的空间供细胞伸展 。当细胞密度为 5×105 / m l左右时 ,试剂及仪器 主要试剂 : 胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松、型胶原酶 、锥虫蓝等购自美国 Sig ma 公司。鼠尾胶为自行配制 。Williams E 培育液 、胎牛血清购自美国 Gibco 公司 。BT01-100 蠕动泵( 保定格兰蠕动泵有限公司)、Sorvall 低温离心机( 美国 Kendro 公司), CL-800 全自动生化分化仪(

6、 日本岛津), XD-101 倒置显微镜( 南京光学显微镜公司)。 Heraeus CO 2孵箱( 美国 Kendro公司), KT-902 洁净室( 无锡康达净化空调设备厂)。试验步骤：一、原代大鼠肝细胞的分别1.试验动物 Spragure- Dawley （ SD ） 大鼠购自泸州医学院试验动物中心。雄性，清洁级，体重 150200g，812 周龄。分笼饲养，喂饲标准的大鼠饲料，任凭饮水，保持室温 20 25 。2.主要仪器设备: 倒置相差显微镜（）；自动平衡微型离心机：LDZ4- 0.8 北京医用离心机厂；套管针（）；超净工作台（）；电子分析天平（）；外科手术器械（）3.主要试剂及药品：

7、 型胶原酶（）；RPMI1640培育基（）；胎牛血清（）；台盼蓝（）；Percoll分别液（）；PBS缓冲液（）；青霉素（80万U）及链霉素（100万U）（）胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松4.具体试验步骤： SD 大鼠，氯胺酮80 mg/kg 腹腔内麻醉同时腹腔内注射 1 000 U 肝素钠注射液抗凝固定大鼠仰卧位于超净工作台上 （用前紫外灯照射超净台半小时），剪去胸腹部体毛，碘伏胸腹部皮肤消毒后，带无菌手套，铺洞巾，取腹部正中切口，可见鲜红的肝脏，暴露出门静脉和肝下下腔静脉，用弯头钳子钝性分别门静脉和下腔静脉，并在各静脉下放置1 根 4 零细线，暂不结扎，用套管针以约 1

8、5°角在门静脉远端向近端平行刺入 （留意针头刺入在距离门静脉 3 个分支处 0.5 cm，刺入过深势必影响灌注效果）细线结扎后以封闭门静脉远端，再退出金属针心，并将套管针连接一次输液器一端，另一端接上输液瓶 （预热灌流液的输液瓶用保温套保持温度以避开温度下降过快以影响酶的消化活性）输液瓶高度距离灌流大鼠肝脏 120 cm打开输液器输钮将预热至 37 无钙灌流液 200mL 经一次性输液管道及连接其末端的套管针流入门静脉，把握流速约 20 mL/min；另一套管针头马上插入肝下下腔静脉，细线结扎固定以防针头由下腔静脉内脱出并退出金属针心，让血液和灌流液从下腔静脉流出，用无菌平皿接流出液

9、，保持流出端无菌，同时打开胸腔结扎肝上下腔静脉，数分钟后肝脏渐渐肿胀变淡黄色直到下腔静脉流出液颜色接近无钙灌流液约 510 min，改输预热至 37 的 0.05%型胶原酶灌流液 100 mL连续灌流，更换流出端的平皿，以回收胶原酶以循环使用，把握约 10 mL/min灌流持续约 510min， 0.05%型胶原酶灌流过程中，取一根无菌湿棉签轻轻压迫肝脏表面，以推断肝脏消化的程度，待压迫肝脏后不再回缩表面消灭渗出、肝包膜下组织呈龟背状裂隙时推断肝脏已被消化充分，可以终止灌流。离断肝脏血管、韧带及系膜，将肝脏完整取下 （留意不要碰破胃肠组织，避开造成污染），置于无菌平皿。用眼科镊钝性撕裂肝组织，

10、4 RPMI 1640 完全培育基终止IV型胶原酶的消化作用，装入无菌 100 mL 三角烧瓶置摇床上，100 r/min，摇 10 min，所得的肝细胞悬液经三层无菌纱布过滤，以除去一些大的细胞团块及被膜组织，再装入 50 mL 离心管，500 r/min，离 心 3 min，弃上清，以4RPMI1640完全培育基重悬，反复离心 3 次，以除去血细胞、肝非实质细胞以及一些细胞碎片和少量的结缔组织。离心之后得到的肝细胞沉淀以含 4 RPMI1640 完全培育基对细胞沉淀进行重悬，用吸管轻轻反复吹打肝细胞悬液使肝细胞重悬均匀后即制备成肝细胞悬液。二、原代大鼠肝细胞的纯化 取无菌的 50 mL离心

11、管置管架上，用弯头吸管沿管壁当心地将肝细胞悬液和 75%Percoll 分别液按 1:1 铺层，底层为 75%Percoll 分别液肝细胞悬液铺加于上层，尽量削减震荡， 4 ， 800 r/min， 10 min离心后，离心管液体分四层，顶层为死细胞，其次层为混合肝细胞，第三层为肝实质细胞，底层为分别液取第三层肝实质细胞用于重悬制成肝细胞悬液外，另吸取其次层混合肝细胞，加 PBS 液稀释，再次当心依次按 1:1:1 分铺底层 50% Percoll、中层 25% Percoll、顶层混合肝细胞悬液，尽量削减震荡， 4 ， 800 r/min， 10min 离心，底层沉淀为肝实质细胞，吸除上层液，用完全培育基重悬底层沉淀的肝细胞制成肝细胞悬液取肝细胞悬液与台盼蓝溶液混匀后 1 min 内滴入血细胞计数板上计数。三、肝细胞原代培育具体步骤RPMI1640完全培育基( 100 mL·L 1胎牛血清RPMI1640培育基培育基、青霉素105 U·L 1、链霉素100 mg·L 1和胰岛素160 U·L 1 ) 调整肝细胞悬液细胞密度，按每孔1 × 106 个细胞接种于铺有肝细胞悬液的6 孔培育板中，在37 、50 mL&