电针穴位刺激对致痫大鼠海马齿状回神经发生及行为学变化影响的实验研究(1)

1、    电针穴位刺激对致痫大鼠海马齿状回神经发生及行为学变化影响的实验研究(1)    】 目的：观察电针刺激百会穴对锂匹罗卡品诱导致痫大鼠海马齿状回神经发生及行为的影响，为进一步揭示穴位刺激治疗癫痫的机制提供基本的实验依据. 方法：选用锂匹罗卡品诱导致痫成年大鼠模型，采用BrdU标记分裂细胞及免疫组织化学方法比较致痫后7,14,42 d时电针刺激穴位干预致痫组大鼠与相应对照组大鼠之间海马齿状回神经前体细胞的增殖速度，并同时观察动物行为学改变. 结果：电针穴位刺激后，明显促进了大鼠致痫后7 d,14 d时齿状回的神

2、经发生水平，BrdU免疫阳性细胞数目较相应对照组明显增加（P<0.01），而致痫后第42日时两组大鼠齿状回BrdU免疫阳性细胞数目无显著性差异（P0.05）. 同时，电针穴位刺激干预组大鼠(存活42 d大鼠)平均每周SRSs次数明显少于电针刺激对照组和无刺激对照组大鼠. 结论：电针刺激百会穴可促进癫痫后海马齿状回神经发生水平的改变，即电针刺激百会穴在一定的程度上参与了癫痫后海马的神经可塑性变化.    【关键词】 电针刺激; 百会穴; 神经发生; 癫痫; 锂匹罗卡品    0引言  

3、60; 近年来有关成年脑组织神经发生的研究发现,缺血、缺氧、外伤、癫痫等许多原因所致的脑损伤均可诱导成年海马齿状回神经元再生的增加,成年哺乳动物脑内神经元再生相关机制的研究已成为神经科学领域内的一个最激动人心的课题1-3. 国内、外相关研究结果表明癫痫后的海马齿状回的神经发生即神经可朔性的改变与癫痫的发生和发作密切相关，而祖国传统医学的理论和实践也显示穴位刺激具有明显的抑制癫痫发生与发作的作用4-5. 因此，在目前我们对穴位刺激治疗癫痫基础研究领域尚缺乏深入实验研究的前提下，探讨电针穴位刺激是否会对海马齿状回神经发生产生影响无疑是一个值得我们关注的内容. 本研究中，我们选用锂匹罗卡品

4、诱导致痫大鼠模型，对致痫大鼠电针刺激百会穴后海马齿状回的神经发生和行为学改变进行了初步观察和研究，旨在为进一步揭示穴位刺激治疗癫痫的机制提供基本的实验依据.    1材料和方法    1.1材料成年雄性SD大鼠，由第四军医大学动物实验中心提供，体质量200250 g. 饲养于1212 h光暗环境，给予标准饮食. 选取SE发作程度依据Ono J分级标准级（含级）以上存活大鼠随机分为电针穴位刺激干预组（n=12）, 电针刺激对照干预组（n=12），各干预组大鼠又分别随机分为致痫后7，14，42 d 3个时间组（每个时间

5、点4只大鼠）. 参考相关文献6-8锂匹罗卡品癫痫模型制作予造模大鼠腹腔注射氯化锂（3 meq/kg,中国医药集团上海试剂公司）,18 h后腹腔注射盐酸匹罗卡品（30 mg/kg,Sigma公司），所有注射匹罗卡品大鼠均于数分钟内出现强直阵孪性发作癫痫持续状态（SE），60 min后腹腔注射地西泮注射液（4 mg/kg）终止发作，以降低死亡率.    1.2方法    1.2.1分组电针穴位刺激干预、BrdU给药方法及脑片标本制备 电针穴位刺激组大鼠（电针刺激致痫大鼠百会穴）和电针刺激对照组大鼠（电针刺激致痫大鼠百会

6、穴相临的非穴位处）均采用G6805型电针治疗仪于致痫后第2日开始进行电针刺激干预，共刺激3 d. 电针刺激参数为：频率为50 Hz,电流强度20 mA,时间20 min， 2次/d. 不同时间点各组大鼠于相应时间点前1 d以BrdU 50 mg/kg （Boehringer Mannheim）腹腔注射给药2次，2 h间隔/次，24 h后予戊巴比妥钠 (40 mg/kg) 麻醉，经升主动脉灌注生理盐水100 mL，40 g/L多聚甲醛液（pH 7.4）500 mL后，断头取脑，将脑组织置入40 g/L多聚甲醛后固定过夜，200 g/L蔗糖4沉底，选择海马部位应用冰冻切片机冠状位连续切片，每隔15

7、0 m取脑片1张，脑片厚30 m，收集于0.01 mol/L KPBS中.    1.2.2免疫细胞化学参考有关文献9对脑片进行染色，具体步骤如下：取切片入500 g/L甲酰胺（Sigma）/2×SSC中65 2 h，2×SSC漂洗后，入2 mmol/L HCl中37 30 min， 0.01 mol/L硼酸液中和10 min，浸入含0.3 g/L Triton X100的0.01 mol/L KPBS 30 min，之后入小鼠抗BrdU抗体（11000，Sigma） 4孵育48 h，再依次入生物素化的羊抗小鼠IgG (1500, S

8、igma)室温2 h、生物素卵白素HRP复合物（1:500, Sigma）室温2 h，最后用葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍胺法呈色. 然后常规贴片、干燥、脱水、透明、封片. 光镜观察. 对照染色用血清稀释液代替第一抗体.            作者：王津存，黄远桂，温晓妮，王卫东，夏峰，王小木，杨方,吴松笛 【关键词】电针Effect of electroacupuncture ap         本

9、篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。    1.2.3行为学观察记录各致痫大鼠首次发作的行为学改变、首次癫痫发作平均潜伏期、注射地西泮前强直阵孪发作次数和持续时间,以及静默期的长短. 此后，每天观察动物的行为学变化4 h，记录存活42 d大鼠静默期后出现的Ono J分级标准10级的自发反复发作（SRSs）次数. 同时在400倍光镜下观察各干预组不同时间点大鼠齿状回颗粒细胞层（GCL）、亚颗粒增生带（SGZ，G

10、CL与门区之间约2个细胞体厚的一层11）及门区BrdU阳性细胞数并进行比较，每只大鼠随机选取45个非连续的脑片进行计数.统计学处理： 实验结果以x±s表示，使用SPSS 11.0软件包行方差分析, P<0.05认为有统计学差异.    2结果    2.1行为学改变匹罗卡品注射后5 min大鼠开始出现烦躁不安、跑动、凝视、站立、点头、咀嚼样动作、湿狗样抖动等表现. 约30 min左右出现面肌抽动、前肢震颤、姿势失衡、跌倒，继之发生全身强直阵挛抽搐，持续12 min. 发作间期动物呈疲劳状态. 注射地

11、西泮后，大鼠逐渐停止癫痫发作，经过520 d的静默期后，进入慢性期的各干预组致痫大鼠均观察到Ono J分级标准级的自发反复发作（SRSs）. 各干预组致痫大鼠首次癫痫发作平均潜伏期、注射地西泮前强直阵孪发作次数和平均持续时间无显著性差异（表1，P0.05）. 电针穴位刺激干预组大鼠(存活42 d大鼠)平均每周SRSs次数明显少于电针刺激对照组和无刺激对照组大鼠（表1，P<0.05）.        表1各干预组致痫大鼠癫痫行为学改变比较(略)    2.2大鼠海马齿状回

12、神经发生的形态学特点致大鼠海马齿状回亚颗粒增生带和颗粒细胞层内可见BrdU阳性细胞分布，高倍镜（400）下观察常可见68个以上BrdU标记阳性细胞“丛集”在一起，但这些细胞细胞核形态往往不规则. 而呈单个或两个相邻的阳性细胞，则细胞核形态相对比较规则（图1）.    2.3致痫大鼠齿状回神经发生水平的影响各组大鼠齿状回BrdU免疫阳性细胞主分布在SGZ，齿状回颗粒细胞层与门区BrdU免疫阳性细胞均较少. 电针穴位刺激后，明显促进了大鼠致痫后7，14 d时齿状回的神经发生水平，BrdU免疫阳性细胞数目较相应对照组明显增加（P<0.01），而致痫后第4

13、2日时两组大鼠齿状回BrdU免疫阳性细胞数目无显著性差异（P0.05，图2）.A：丛集性分布的BrdU免疫阳性细胞；    B：单个或两个分布的BrdU免疫阳性细胞. 箭头所示为BrdU免疫阳性细胞.    图1大鼠致痫后齿状回亚颗粒增生带BrdU免疫阳性细胞分布模式×400    图2大鼠致痫后电针穴位刺激对不同时间点齿状回BrdU免疫阳性细胞数目的影响    3讨论    众所周知，

14、在祖国传统医学的漫长发展过程中积累了大量理论和实践经验的针灸穴位治疗癫痫是一种非药物性的抗痫治疗手段，其疗效在众多的国内外学者中已达成共识，其具有的安全、简便易行且副作用小的特点更是为大家广泛接受. 但是由于对针灸穴位刺激治疗癫痫的基础研究领域目前尚缺乏深入的实验研究，使得针灸穴位治疗癫痫的工作在临床推广和提高其疗效上受到了极大的限制. 近年来，人们应用BrdU标记细胞分裂的方法，发现在小鼠、大鼠、兔、豚鼠、鸟、猴及人脑中均有神经发生现象，只不过这些发生现象仅局限于脑内某些特定区域，如海马齿状回亚颗粒增生带(subgranular proliferative zone, SGZ)和前脑脑室下带

15、(subventricular zone, SVZ)等. 在某些生理刺激和包括癫痫发作在内病理状态下，这些部位的神经发生水平明显增高，并且国内、外一些相关研究结果也表明癫痫后的海马齿状回的神经发生即神经可朔性的改变可能与癫痫发作的易感性密切相关. 由于海马是与癫痫发作有关的重解剖学结构，并且针灸穴位刺激所产生的调节脑内乙酰胆碱(Ach),内啡肽(ED),5羟色胺(5HT)等中枢介质，以及可以使兴奋性氨基酸的含量下降, 抑制性氨基酸水平相对或绝对升高等广泛生理学效应均参与了癫痫后海马齿状回神经发生的过程4. 因此，我们有理由相信穴位电刺激治疗癫痫有可能最终是通过影响脑内与癫痫发作有关的解剖学部位

16、神经发生即可塑性变化而发挥疗效的.由于以往我们进行的实验研究结果已经显示了电针刺激百会穴对改善致痫大鼠脑电图和行为学表现的作用，证实它的抑痫效果. 因此，本研究中我们重点观察了电针刺激百会穴对致痫大鼠海马齿状回神经发生水平的影响. 结果显示所有实验大鼠注射匹罗卡品后均出现癫痫发作，其行为学改变大致相同，大鼠停止癫痫发作经过520 d后进入慢性自发反复发作期，在此期间电针穴位刺激干预组大鼠平均每周SRSs次数明显少于电针刺激对照组和无刺激对照组大鼠. 形态学观察发现各干预组大鼠齿状回BrdU免疫阳性细胞主分布在SGZ，齿状回颗粒细胞层与门区BrdU免疫阳性细胞均较少. 电针穴位刺激干预组大鼠致痫

17、后7 d, 14 d时齿状回BrdU免疫阳性细胞数目较相应对照组明显增加，而致痫后第42日时两干预组大鼠齿状回BrdU免疫阳性细胞数目无显著性差异. 这一结果表明电针刺激百会穴可促进癫痫后海马齿状回神经发生水平的改变，即电针刺激百会穴在一定的程度上参与了癫痫后海马的神经可塑性变化. 而相对于致痫后第42日时两干预组大鼠齿状回神经发生水平无显著性差异这一现象，我们认为它的出现可能与进入慢性期后对照干预致痫大鼠SRSs次数明显多于电针穴位刺激治疗干预大鼠有关，是这种多次的自发反复发作对齿状回神经发生的影响干扰了结果，还是电针穴位刺激治疗的时效性导致这一现象，我们尚不清楚.根据以往的研究结果，我们知

18、道癫痫后海马的神经可塑性改变除了神经发生以外，还包括了苔藓纤维出芽以及突触重建等多种组织结构的变化，所有的这些可塑性的改变都有可能导致局部异常放电神经元的功能和结构的长期改变，从而参与纠正清楚中枢神经系统中业已形成的异常放电的错误行为印迹的过程，进而影响癫痫的进程和结局12-13，但从另一个层面来讲局部神经元的功能和结构的长期改变又可导致新的异常放电形成，增强易感性. 总之，致痫后海马局部神经可塑性的改变是一个异常复杂的过程，据包括我们实验在内的实验结果可以初步认定电针穴位刺激治疗癫痫的解剖学基础可能与海马部位存在的神经发生有着密切的联系，但它们之间的关联性还有待我们进一步探索. &

19、#160;  【参考文献】1 Eriksson PS, Perfilieva E, BjorkEriksson T, et al. Neurogenesis in the adult human hippocampusJ. Nat Med, 1998,4（11）:1313-1317.            作者：王津存，黄远桂，温晓妮，王卫东，夏峰，王小木，杨方,吴松笛 【关键词】电针Effect of electroacupuncture ap 

20、;        本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。2 Dash PK, Mach SA, Moore AN. Enhanced neurogenesis in the rodent hippocampus following traumatic brain injuryJ. J Neurosci Res, 2001,63(4):313-319.3 Wang WD, Jian

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