实验一分光光度计性能检测.

1、实验一分光光度计性能检测【实验目的】1、掌握分光光度计的性能检测，包括波长检测、杂光检测以及比色皿配对。2、掌握分光光度计的使用方法。【实验原理】1、波长检测：可见光区域的黄光波段比较狭窄，适用于光度计波长的粗测；镨钕滤光片在529nm±1 2nm 处有较好的吸收峰，适用于光度计波长的细测。2、杂光检测：镨钕滤光片在 585nm 处吸光度 A 最大，透光率 T 最小，所产生的透光与杂光成正比，因此可用其透光率表示杂光的大小。3、比色皿配对：一套比色皿之间的材质、厚薄、色泽、空白吸收等应该一致，误差小于0.5%才能配套使用。【试剂与器材】1、镨钕滤光片、白纸条、黑纸片、蒸馏水等；2、

2、722 型分光光度计、比色皿。【操作步骤】一、操作1、波长检测(1)粗测：调仪器波长旋纽至580nm 处，打开遮光板，在比色槽中光路经过处放一白纸条，观察是否有均匀的黄光。(2)细测：调波长至 529nm 处，打开遮光板，调 0%T ，盖上遮光板以空气调 100%T ，将镨钕滤光片插入光路，测出 A 值。再在 529nm 附近每隔 1 2nm，各测其 A 值。2、杂光检测(1)调波长为585nm，盖上遮光板，用黑纸挡住比色皿光路，调0%T 。(2)盖上遮光板，用空气作空白调100%T 。(3)插入镨钕滤光片，盖上遮光板，测出585nm 时的 T%，即为杂光水平。3、比色皿配套(1)选取几支大小

3、、 材质、色泽相同的比色皿，洗净， 装入占比色皿体积2/3 的蒸馏水 (D.W.) ，擦干，放入比色槽。(2)在 585nm 处，调第1 支比色皿透光度为100%T ，依次测出其他几支比色皿的T%。不合格的需反复剔除极端值，或重新配对，直至有2 个以上的比色皿合格。二、结果及讨论【参考范围】1、波长的检测：在529nm ±1nm 处有最大吸收值为合格。2、杂光的检测：T% 5%为合格。3、比色皿配套：T max % T min% 0. 5% 为合格比色皿配套。【注意事项】1、 722 型分光光度计的使用方法：选定检测波长，置调节模式为透光率T ，将某一盛装参比介质的空白比色皿置于光路

4、，打开遮光板，调0%T ，盖上遮光板调100%T，再将盛装待测液体的比色皿置于光路， 测出 T 值，或置调节模式为吸光度A ，即可测出 A 值。注意每次测定均需重新调0%T 、100%T 。2、在杂光检测中，用于调0%T 的黑纸片应完好无孔洞，否则会导致假合格现象。3、使用比色皿时，其盛装液体不能超过总体积的2/3，也不宜少于1/2，且在检测前必须用擦镜纸将比色皿外的液体擦拭干净。1实验二方法学评价试验（1） 线性范围试验【实验目的】1、掌握线性范围试验的原理及方法。2、掌握葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（GOD-POD ）法测定葡萄糖（Glu ）。3、熟悉分光光度计的使用。【实验原理】使用不同浓度

5、的葡萄糖标准溶液，用 GOD-POD 法试剂测定各自的吸光度，以标准浓度为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标，在方格纸上作图，即可绘制出一条直线，即剂量反应曲线。一般测定方法的线性范围要求能覆盖临床上的参考值和常见疾病的医学决定水平，以减少标本稀释重测的机会。【试剂与器材】1、蒸馏水， Glu 标准液， GOD-POD法酶试剂。2、 722 型分光光度计，比色皿。【操作步骤】一、样品的处理与测定1、原始的葡萄糖标准溶液浓度为110mmol/L ，设为第1 号管，将其稀释后得到2 种高浓度的葡萄糖标准溶液管：第2、 3 号管。注意稀释后要混匀。2号管3号管110mmol/L 葡萄糖液（ l）100

6、50D.W. （l）5050葡萄糖液浓度（mmol/L ）73.33552、再将第 2、 3 号管分别取 50l，加 D.W.50 l依次作等倍稀释（各 4 管），得到 8 种较低浓度的葡萄糖标准溶液，稀释方法见下图：管号246810357911浓度（ mmol/L ）73.3336.6718.33 9.174.585527.513.756.883.443、取 12 支试管，其中设有空白管（B）。按下表操作：试管编号B1234567891011D.W. （ l）10葡萄糖标准液（ l）1010101010101010101010酶试剂（ ml）1.51.51.51.51.51.51.51.51

7、.51.51.51.5混匀， 37水浴 15 分钟，取出冷却至室温，在505nm 处用 0.5cm 的比色皿， B 管调零，测各管吸光度吸光度 A0标准液浓度 C011073335536.6727.5183313759.176.884.583.44（mmol/L ）二、绘制 A-C 曲线2在坐标纸上，以吸光度A 为纵坐标，葡萄糖浓度C 为横坐标绘制A-C 曲线。三、结果及讨论【参考范围】该方法的线性可达22.24 mmol/L 。【注意事项】1、 Glu 标准液的加入量必须十分准确，应用计量性能准确度很高的微量进样器加样。准确加量是最主要的技术关键。这对于后面所有需要微量加样的定量实验均是如此

8、。2、标准管系列中每管平行做3 管取平均值。3、造成线性变窄的原因为试剂配制中组分投料不足。试剂配制后组分稳定性差。4、有的测定特别是酶法测定，当酶量相对不足时，用标准液所作的线性范围可以达到指定的高限，但在测定同样高值样品时，结果却明显偏低，这往往是样品中的介质效应引起的，值得注意。实验三方法学评价试验（2） 重复性试验【实验目的】1、掌握批内重复性试验的原理及操作方法。2、了解双缩脲法测定总蛋白TP 的操作方法。【实验原理】“五同一短 ”：同一方法、同一人、同一器材、同一实验室、同一测定条件（标本、标准品和试剂相同，温度、湿度、pH 等相同）下，短期内重复测定。指标用批内CV 来评价。【试

9、剂与器材】1、双缩脲试剂、蛋白质标准液；2、 722 型分光光度计。【操作步骤】一、操作：采用双缩脲法，设置标准和空白，同一标本用对比法测定10 份（ n 10）。按加样：试剂比 =50l： 2.5ml ， 37水浴 10min ， 540nm，测定出 TP 标准液的吸光度A s 和样本的吸光度 A i。二、计算：AiX S 计算出样本中TP 浓度 X i。据 X iASnn(xi )22i 1xis = i 1nn1三、结果及讨论1 nxi ， CV s， x100 n i 1x【参考范围】一般要求批内CV 5。【注意事项】1、为了缩小测定值的离散程度，操作中必须准确加入标准液及标本量，并严

10、格控制反应时间，准确读数。2、严格遵守 “五同一短 ”的原则，尽量减少人为误差。3实验四、方法学评价试验（3） 回收试验【实验目的】1、掌握回收试验的原理及操作方法。2、掌握 GOD-POD法测 Glu 的原理。【实验原理】回收是指候选方法准确测定加入常规分析标本的纯分析物的能力，用回收率表示。 将被测物标准液加入病人标本中， 成为分析标本； 原病人标本中加入等量的无被测物的溶剂作基础标本；然后用候选方法测定并得到各自浓度。回收浓度 =分析标本测得浓度基础标本测得浓度加入浓度 =标准液量ml标准液浓度标准液量 ml病人样品量 ml回收浓度回收率（ %） =100加入浓度【试剂与器材】1、 血清

11、，蒸馏水，Glu 标准液， GOD-POD法酶试剂。2、 722 型分光光度计，比色皿。【操作步骤】一、样品的处理（已制备）1、基础血清管= 原血清 0.9ml+ 蒸馏水 0.1ml2、回收管= 原血清 0.9ml+ 相应的 Glu 标准液回 1 =原血清 0.9ml+ 11.1mmol/L的 Glu 标准液 0.1ml回 2 = 原血清 0.9ml+33.3mmol/L 的 Glu 标准液 0.1ml回 3 =原血清 0.9ml+111mmol/L的 Glu 标准液 0.1ml二、操作与计算取量加酶试剂吸光度Glu加 入后值实测浓度 C=（ A/A1）×C1回收率 R平均回收率RR

12、三、结果及讨论空 白标准 S原血清基础血清 回1T2回 2T3回 3T4BT0T1各 20 l各 3 ml摇匀， 37水浴 10 分钟后， B 管调零，测各管吸光度A 1A 2A 3A 4A 5A 6add =1.11add =3.33add =11.1231C =5.5C2C3C4C5C616R1R2R3其中，C4 C3C5C3C6 C3RR2R31add1add2add3RRR1R2R3，有 R< 0 的舍去，注意分母随其变化。34【参考范围】回收率： 100%± 5%【注意事项】1、分析物浓度应选择医学决定水平，血糖测定的医学决定水平为2.8、 6.7、8.9mmol/L

13、 。2、纯标准溶液的加入体积不得超过血清样品的10%，避免将血清稀释过度，引起误差的改变或消失。实验五方法学评价试验（4） 干扰试验【实验目的】1、掌握干扰试验的原理及操作方法。2、熟悉 GOD-POD 法测 Glu 的原理。【实验原理】干扰试验是用来检测候选方法的恒定系统误差。 干扰物浓度不同， 误差大小也不同。 本实验将干扰物质维生素 C（ VC）配成一定浓度的溶液，加到病人标本中成为干扰分析样本；原病人标本加入相同量的无干扰物质的溶剂作为基础样本； 然后用候选方法对此两种样本同时测定， 两者之差即表示该干扰物质产生的干扰所引起的误差，即干扰值。干扰值 =分析标本测得值基础标本测得值【试剂

14、与器材】1、血清、蒸馏水、Glu 标准液、 GOD-POD 法酶试剂；2、 722 型分光光度计、比色皿。【操作步骤】一、样品的处理（已制备）1、基础血清管= 原血清 0.9ml+ 蒸馏水 (D.W.)0.1ml2、干扰管= 原血清 0.9ml+ 相应的维生素C 干扰液 0.1ml干 1 = 原血清 0.9ml+10 mmol/LV C 干扰液 0.1ml 干 2 = 原血清 0.9ml+20mmol/L V C 干扰液 0.1ml二、操作与计算空白 B标准 S原血清 T0基础血清 T 1干 1T2干2T3取量各 10 l加酶试剂各 1.5 ml摇匀， 37水浴 10 分钟后，用0.5cm 的

15、比色皿， 505nm ，B 管（蒸馏水 D.W. 试剂）调零，测各管吸光度吸光度A 1A 2A 3A 4A 5Glu 加入后值Add 1=1Add 2=2实测浓度 C=C1=5.56C2C3C4C5（A/A1 ）×C11mmol/LVcE12E的干扰值 E其中，C4C3E2C5 C3E1add2add151mmol/LVcE1E2，有 E>0的舍去，注意分母随其变化。EE2的平均干扰值 EE三、结果及讨论【参考范围】在血糖测定的医学决定水平2.8、 6.7、 8.9mmol/L 时，偏差（ Bais）应小于0.56mmol/L 。【注意事项】1、可疑干扰物浓度可加入可疑干扰物的

16、浓度应明显高于通常所见浓度的上限，有时可能达到病理标本的最高值，尿酸升高的变动范围在0.420.9mmol/L 之间。2、凡可疑干扰物都应做，此处仅是举例示范。3、无论是方法特异性或是受干扰，都影响到测定结果的正确性，影响的程度与分析物的浓度无关，但与非分析物的两有关，所以产生的误差都是恒定系统误差，常以偏差Bias 作为统计量。Bias 指所有测定值系统性地偏差真值， 表示系统误差的大小。 在干扰试验中， 偏差等于干扰样品测定值与基础样品测定值之差。4、分析物浓度应选择医学决定水平，血糖测定的医学决定水平为2.8、 6.7、 8.9mmol/L 。5、纯标准品溶液的加入体积不得超过血清样品的

17、10%，避免将血清稀释过度，引起误差的改变或消失。实验六方法学评价试验（4） 对比试验【实验目的】1、掌握方法对比试验的原理及操作步骤。2、掌握双缩脲法及折射率法测定血清TP。【实验原理】方法对比试验是将候选方法与准确度已知的方法（如参比方法） 作对比分析， 以评价候选方法的准确度，是考核候选方法是否可被采用的重要试验。 方法对比试验是用于检测候选方法系统误差的大小包括恒定误差和比例误差，如对适当的数据进行分析，也可以提供误差的性质。【试剂与器材】1、双缩脲试剂、质控血清、蒸馏水等；2、 722 型分光光度计、比色皿、水浴箱。【操作步骤】一、样品处理1 10 号样本：质控血清+不同体积的蒸馏水

18、（4.5ml、 4.0ml、3.7ml 、3.5ml 、3.2ml 、3.0ml 、2.7ml 、2.5ml 、 2.2ml 、 2.0ml ），混匀。二、样品测定1、双缩脲法：设置标准和空白，用对比法测定。按加样：试剂比=50 l：2.5ml ， 37水浴 10min ，540nm ，测定出 TP 标准液的吸光度 A s和样本的吸光度Ai ，并据 X iAiX S 计算出样本中TP 浓度 X i。AS2、折射率法：先调标，再测样本中TP 浓度 Y i。6吸光度双缩脲法浓度X i折射率法浓度yi浓度差 (di=Y i-X i )相关和回归三、统计学检验BST 1T 2T10A sA 1A 2A

19、 10Xs=50g/Lx1x2x10Ys=50g/Lyy2y101d1d2d10y=a+bx1、相关与回归：计算出a、 b、 r 及 t 值，进行r 的 t 检验。x1nxi1 nn i，yyi1n i1nn1n22l xxxix2xixin ii1i11nn1n2l yyyiy 2yi 2yii1i1ni 1nn1nnl xyxi xy iyxiy ixiy ini1i1i1i 1blxyybx ,rl xyl， alxx l yyxxtr， n 2 = 8，双侧 t 2.3060.051r 2n2?bx回归方程为： y a若 t>t 0. 0 5，则按 0.05的水准拒绝 H 0（两

20、变量无直线相关关系），接受H1（两变量有直线相关关系）；否则，结果相反。2、配对 t 检验：计算出 d、 sd 及 t 值，进行两种方法间的配对t 检验。nd i )2n(2i 1nd i1d isd =i 1n，di =Y i-X i ， dn i1n1d， n 1 = 9，双侧 t 0. 0 52.262t=sdn若 t>t 0. 0 5，则按 0.05的水准拒绝 H0（两变量无差别），接受H1（两变量有差别）；否则，结果相反。7四、结果及讨论【参考范围】a0； b1【注意事项】1、选择试验样品应包括常规工作中可能遇到的整个分析范围，选择合适的样品分析范围比增加样品数目更为重要；2、

21、一般每个样品用两种方法各测一次，最好每个样品用两种方法各测定两次，取其平均值；3、对比方法的选择十分重要，一般应选参考方法或决定性方法，这样方法间的任何分析误差均可归于被评价的候选方法。实验七、八血浆蛋白测定（1）、（ 2） 双缩脲试剂的制备与鉴定、 【实验目的】1、掌握双缩脲试剂的制备与鉴定原理。2、熟悉重量分析与容量分析的基本操作。【实验原理】1、准确称取一定量的物质，溶解后，定量转移到容量瓶中，稀释至一定体积，根据称取物质的质量和容量瓶的体积，即可算出溶液中该物质的准确浓度。2、蛋白质中的肽键（ CONH）在碱性条件下与Cu2+络合成紫红色复合物，产生的颜色强度在一定范围内与蛋白质含量成

22、正比。此反应和二分子尿素缩合后的产物双缩脲（ H2N CO NH CO NH 2）与碱性铜溶液作用形成紫红色的反应相似，故称为双缩脲反应。3、合格的双缩脲试剂应为均一的天蓝色溶液，不呈胶体状、无沉淀。试剂空白吸光度约在0.070，对定值血清的测定值应在许可范围内。【试剂与器材】1、硫酸铜结晶（CuSO4·5H2O），酒石酸钾钠，碘化钾，氢氧化钠，蒸馏水（D W）。2、试管，天平，烧杯，100ml 容量瓶， 722 型分光光度计。【操作步骤】一、双缩脲试剂的制备1、 NaOH 溶液的制备用两支干净的塑料试管配平天平后，称取2.4gNaOH 于试管中用少许D W 溶解。2、双缩脲试剂的制

23、备称取硫酸铜结晶 （ CuSO4?5H2O）0.3g 于烧杯中用DW 溶解后，加入酒石酸钾钠 （NaKC 4H4O6?4H2O）0.9g，用 DW 溶解后，再加入碘化钾（KI ）0.5g，加 DW 溶解，再边搅拌边加入已配好的NaOH溶液，用D W 定容至100ml 容量瓶中。二、双缩脲试剂的鉴定1、理学检查：均一的天蓝色溶液，不呈胶体状、无沉淀。2、试剂空白吸光度及定值血清的测定(校准液浓度： 50 g/L)8空白（ B）校准（ C）测定（ U）样 品（ L）-50校准液（ L）-50-D W （ L）50-试剂 R1（ L）250025002500混匀， 37水浴 10min ， 540n

24、m， 0.5cm 的比色皿， D W 调 0，测定 3 管的吸光度结果：试剂空白吸光度约在0.070，对定值血清的测定值应在许可范围内。【注意事项】1、准确称量、溶解是关键。2、酒石酸钾钠用以结合 Cu+ ，防止 CuO 在碱性条件下沉淀； KI 可防止碱性酒石酸铜自动还原并防止 Cu2O 的离析。实验九血浆蛋白测定（3） 溴甲酚绿法测定白蛋白【实验目的】1、掌握溴甲酚绿法测定白蛋白的原理及操作方法。2、了解测定白蛋白测定的临床意义。【实验原理】血清白蛋白在pH4.2 的缓冲液中带正电荷，在有非离子型表面活性剂存在时，可与带负电的染料溴甲酚绿（ BCG ）结合形成蓝绿色复合物，在波长 630n

25、m 处有吸收峰，其颜色深浅与白蛋白浓度呈正比，与同样处理的白蛋白标准比较，可得到血清中白蛋白含量。【试剂与器材】1、溴甲酚绿试剂、标准液、待测血清；2、 722 分光光度计、比色皿。【操作步骤】一、样品处理取洁净试管 3 支，按下表操作加入物（ ml ）空白管（ B）标准管（ S）测定管（ T ）血清-0.02Alb 标准液-0.02-DW0.02-BCG 试剂4.04.04.0二、样品测定在波长 630nm 处用空白管调零，用定量加液器加 BCG 试剂；混匀，立即在 30s±3s 内测定吸光度。三、计算血清白蛋白（ g/L ） = ATC SAS四、结果及讨论【参考范围】正常成人3

26、5 - 55 g/L【注意事项】91、BCG 是一种 pH 指示剂，变色域为 pH3.8（显黄色） - 5.4（显蓝绿色），因此控制反应液的pH是本法测定的关键。2、配制 BCG 试剂也可用其他缓冲液如枸橼酸盐或乳酸盐缓冲液。但以琥珀酸盐缓冲盐的校正曲线通过原点，线性好，灵敏度高，成为首选推荐配方。3、试剂中的聚氧化乙烯月桂醚 （Brij - 35 ）也可用其他表面活性剂代替，如吐温 20 或吐温 80，终浓度为 2ml/L ，灵敏度和线性范围不变。4、当用 60g/L 的白蛋白标准液与 BCG 结合后，溶液光径 1.0cm，在 630nm 处测定的吸光度应为0.811 ±0.035

27、，如达不到此值，表示灵敏度较差。5、蛋白质标准是一个复杂问题。实验证明，BCG 不但与白蛋白呈色，而且与血清中多种蛋白质成分呈色，其中以1 球蛋白、运铁蛋白、结合珠蛋白更为显著，其反应速度较白蛋白稍慢。由于在30s内呈色对白蛋白特异，故BCG 与血清混合后，在30s 读取吸光度，可明显减少非特异性呈色反应。为了减少本法基质效应的影响，最好用参考血清作标准。实验十血浆脂类测定（1） GPO-PAP法测定甘油三酯【实验目的】1、掌握 GOD-PAP 法的检测原理。2、掌握用 GOD-PAP 法检测甘油三酯的操作步骤。【实验原理】1、甘油三酯 +H 2LPL甘油 +脂肪酸2、甘油 +ATPGKO3-

28、磷酸甘油 +ATP3、3-磷酸甘油+OGPO磷酸二羟丙酮+H 2O2POD醌亚胺 +H 2O24、H 2O2 +4-AAP+4- 氯酚醌亚胺为红色化合物，其显色程度与TG 的浓度呈正比。【试剂与器材】1、检测试剂1（ R ）： 4-氯酚、 GoodS、12、检测试剂2（ R ）：除4-氯酚、 GoodS以外的反应试剂23、甘油三酯校准液： 2.26mmol/L【操作步骤】一、样品测定（一步法）工作液：取 R1 和 R2 按 4： 1 混合即为工作液。空白（ B）校准（ C）测定（ U）样 品（ L）-10校准液（ L）-10-D.W. （ L）10-工作液（ L）100010001000混匀，

29、 37水浴 10min ， 505nm 波长，垫好比色皿，以空白管调0，测定各管吸光度。二、 结果计算样品 TG 含量（ mmol/L ）=Au×CcAc三、结果及讨论【参考范围】10血清 TG 正常范围： 0.55 1.70 mmol/L ；临界阈值： 2.30 mmol/L ；危险阈值 4.50mmol/L 。【注意事项】1、本方法没有进行抽提和吸附，所以血清中游离的甘油对TG 测定结果有一定影响。2、常用外空白法和内空白法来消除游离甘油的影响。外空白法即同时使用不含LPL 的酶试剂测定游离甘油，差值即可消除甘油影响；内空白法即双试剂法，LPL 和 4-AAP 组成试剂，其余部分

30、为试剂。3、方法中所用的酶试剂在4避光保存，至少可稳定3 天至 1 周，出现红色时不可再用，试剂空白的吸光度应0.05；4、标本 4存放不宜超过3 天，避免 TG 水解释放出甘油；5、本实验方法的线性上限为 11.3mmol/L ，若所测 TG 值超过了 11.0 mmol/L ，则可用生理盐水稀释后再测。实验十一血浆脂类测定（2） 免疫透射比浊法测定载脂蛋白A1【实验目的】掌握免疫透射比浊法测定载脂蛋白A1 的原理及操作方法。【实验原理】人血清或血浆中载脂蛋白A1与其相应抗体（羊抗人载脂蛋白A1血清）在液相中相遇，立即形成抗原 -抗体复合物，并形成一定浊度。与通过同样处理的校准血清比较，即可

31、计算出样品中载脂蛋白A1的含量。【试剂与器材】1、 ApoA1 检测试剂 R（羊抗人 ApoA1 血清、消脂剂）； ApoA1混合校准血清 (4 瓶冻干粉 )。2、 722 型分光光度计。【操作步骤】一、样品处理将 4 瓶含 ApoA1 的混合校准血清冻干粉分别用0.5 ml D W 或去离子水复溶，再将其中的最高浓度管作对倍稀释，共形成5 种浓度梯度，见下表：编号12345ApoA1(g/L)0.420.781.051.332.10对 ApoA1按下表操作：空白（ B）校准（ S）测定（ T）样品（ L）-20校准液（ L）-20-D W （ L）20-试剂 R（ L）20002000200

32、0二、样品测定混匀， 37水浴 10 分钟，主波长340nm，副波长 700nm，空白管调0，测定各管吸光度。三、数据处理校准曲线法三次方程法11 Log-Logit4p 法四、结果及讨论【参考范围】ApoA1 ： 1.00-1.60g/L【注意事项】1、购买效价高、单价特异的ApoA1 抗血清。2、为了准确测定ApoA1 ，必须作标准曲线。3、免疫透吸比浊法应以多点（5-7 点）定标，按曲线回归计算。实验十二含氮化合物测定（1） 两点法测定肌酐【实验目的】掌握两点法测定肌酐的原理及操作方法。【实验原理】肌酐与碱性苦味酸试剂反应生成黄红色络合物，在500nm 处选择线性较好的两个吸光度值，与通

33、过同样处理的标准液比较，即可计算出血中肌酐含量。【试剂与器材】1、碱性苦味酸试剂、肌酐标准液、蒸馏水；2、 722 型分光光度计。【操作步骤】一、标准液吸光度变化值的测定：按加样：试剂=0.20ml：2.00ml ，混合均匀，倒入干净比色皿中，立刻记时，在 20 秒钟时， 510nm 处读取吸光度值A S1，在第60 秒时，再读取吸光度值 A S2 。得到 A S= A S2 AS1。二、样品吸光度变化值的测定：同上，得到 AT = A T2 A T1 三、计算 A T肌酐浓度 CT =×CS （ 133mol/L ） A S四、结果及讨论【参考范围】男性： 44 133 mol/L

34、 ；女性： 70 - 106 mol/L【注意事项】1、据报道碱性肌酐苦味酸复合物的最大吸光度在485nm，过量苦味酸离子存在于反应液中，在波长低于 500nm 时会产生明显的吸收。2、反应温度以15 25为宜。 10以下，会抑制Jaffe 反应；温度过高，可使碱性苦味酸溶液显色更深。3、显色后标准管色泽较稳定，但测定管吸光度随时间延长而增加，可能与血标本中存在的非特异性物质有关，故在加显色剂后30min 内比色为宜。3、 苦味酸一定要纯，否则会使试剂空白吸光度增加而影响测定结果。12实验十三含氮化合物测定（2） 尿酸酶过氧化物酶法测定尿酸【实验目的】掌握尿酸酶过氧化物酶法测定尿酸的原理及操作

35、方法。【实验原理】尿酸在尿酸酶的催化下， 氧化生成尿囊素 和 H 2O2，H2O2 通过 Trinder 反应，生成的醌亚胺在520nm处有最大吸收， 其程度与血清中尿酸含量成正比，与同样处理的尿酸标准液比较，可求出血清中尿酸的含量。反应式如下：尿酸 +O尿酸酶尿囊素+ CO22222+2H O+2H OH 2O2 + 4-氨基安替比林+ 3 ， 5-二氯 -2-羟基苯磺酸过氧化物酶醌亚胺 + 2 H2O【试剂与器材】1、酶混合试剂、尿酸标准液、去离子水等；2、 722 型分光光度计、比色皿。【操作步骤】一、操作按下表操作：加入物空白管 (B)标准管 (S)测定管（ T)样本 l25标准液 l

36、25试剂 ml1.01.01.0混匀， 37水浴 10 分钟，取出冷却至室温，垫好比色皿，520nm 处空白管调零，测定吸光度A S、A T。二、计算ATS mol/LCTCS ， 其中 C =297AS三、结果及讨论【参考范围】男性： 149 416 mol/L ；女性： 89 357mol/L【注意事项】尿酸标准液浓度在 178.6 713.8 mol/L 范围内线性良好， 如果测定结果超过 1470mol/l，需用生理盐水将标本按 1： 1 稀释后，重新测定，结果乘以 2。实验十四无机离子测定（1） 火焰光度法测定钾、钠【实验目的】1、掌握火焰光度法测K +、 Na+的原理和操作方法。2

37、、了解测定K +、 Na+ 的临床意义。【实验原理】火焰发射光谱法（FES）是一种原子发射光谱分析技术，利用火焰的热能使原子被激发而发射出特13异的光谱进行分析。钠的特征谱线为589nm(黄色 )；钾的特征谱线为767nm（深红色） ；样品溶液中钠、钾浓度与发射光谱强度成正比。 用已知含量的标准溶液与待测标本相比， 即可计算出血清、 尿液中的钠钾浓度。【试剂与器材】1、标准溶液、待测血清、去离子水等；2、 HG-3 型火焰光度计、气源。【操作步骤】一、预处理样品与标准均做1：100 的稀释（已制备）二、含量测定1、打开空气泵，调空气压为0.4kg/cm 2 （ 0.04Mpa ）2、打开测定开

38、关及燃气压开关，适当调大煤气量3、点火，调节火焰呈淡蓝色4、测 K +：(1)打开测 K+ 开关(2)用去离子水调零(3)用 k+标准液（ 4mmol/L ）调标至检流计刻度为40，即 k+ 的标准读数(4)测样品，读刻度(5)计算血清K 浓度测定读数4mmol/ L标准读数5、测 Na+ ：测 Na+ 标准液（ 140mmol/L ）同上，调刻度为70。血清 Na 浓度测定读数140mmol / L标准读数三、结果及结果分析【参考范围】血清钠 135 145mmol/L；血清钾3.6 5.1mmol/L【注意事项】1、溶血或延迟分离血清可使血清钾浓度升高，应及时分离血清，置于有塞试管内冰箱保

39、存。2、测定用玻璃器皿必须用去离子水冲洗干净，不得有离子污染。3、血清稀释必须正确，若遇血清标本结果异常偏低时，必须反复测定及核对。4、火焰光度计的各管道应保持畅通，不得有堵塞，燃料气压及助燃气压应保持恒定，并有一定比例，应防止室内空气流动造成的火焰摆动。5、所用燃料为易燃物，有一定的危险性，应注意安全。实验十五无机离子测定（2） 硫氰酸铁比色法测定氯【实验目的】掌握硫氰酸汞比色法测定氯的原理及操作方法。【实验原理】血清中的氯离子与试剂中的硫氰酸汞反应，生成SCN-及溶解又不解离的 HgCl 2，SCN- 与试剂中的3形成红褐色的-FeFe(SCN) 3,其颜色深浅与 CI 浓度成正比， 在波长 480nm 处测定吸光度， 与通过同样处14理的标准液比较，从而可求出血清氯的含量。2CI- + Hg （ SCN） 2 HgCI 2+2SCN -3SCN+ Fe3 Fe(SCN) 3【试剂与器材】1、饱和硫氰酸汞溶液、硝酸汞溶液、硝酸铁、浓硫酸、1mol/L NaCl 标准贮存液、 100mm