荧光原位杂交FISH实验步骤与方法

1、FISH实验步骤一、实验仪器：荧光显微镜:高速离心机：可达12000r/min高压灭菌锅：160以上杀菌恒温箱：为杂交提供恒定温度恒温水浴锅照相机（与荧光显微镜配套）：荧光捕捉图片二、试剂的配制：1、0.2mol/ L (pH7.4磷酸缓冲溶液(PB试剂为NaH2P04·2H20和Na2HP04·12H2O。-02M的NaH2P04溶液: 31.2g NaH2P04·2H20,加蒸馏水1000mL溶解-02M的Na2HP04溶液: 71.632g Na2HP04·12H2O 加蒸馏水至1000ml溶解-02M (pH7.4磷酸缓冲溶液(PB : 19ml

2、的NaH2P04溶液和81ml的Na2HP04溶液充分混合高压灭菌，常温保存。2、0.03 mol/ L磷酸盐缓冲溶液（(PBS）试剂为NaCl和磷酸缓冲溶液PB-0.03MPBS溶液：22.8gNaCl ，150ml磷酸缓冲溶液(PB ，加蒸馏水至1000ml，混匀-0.02 MPBS溶液：取100ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml-0.01 MPBS溶液：取50ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml高压灭菌，常温保存。3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通风橱内进行操作）-将略小于2/3体积的水（660ml）加热到

3、50，-40g多聚甲醛PFA，边搅拌边加入到水中，继续保持60-1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。-1/3体积的PBS溶液，-用Hcl将pH调至7.2，定容，-用孔径为0.22m的滤膜过滤，-4保存最多保存两天，或者取少量保存在-20。（加热时温度不宜过高，为60-65，否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否则固定效果较差）。4、1mol/L(pH8.0Tris-HCl缓冲液的配置-121.1g Tris(三羟基氨基甲烷, 加800mL蒸馏水溶解，加入大约42mL的浓HCl-用1M的HCl或lM的NaOH将pH调至8.0，最后加蒸馏水至1000Ml高压灭菌，4冰箱保存。

4、5、10%SDS-10g SDS（十二烷基硫酸钠）于50ml灭菌水中，加水至100ml，分装后室温保存。灭菌，或用滤膜过滤称取SDS时需戴口罩！6、0.5M EDTA（pH8.0）溶液的配置- 186.1g乙二胺四乙酸二钠 加800mL蒸馏水溶解，剧烈搅拌(最好使用磁力搅拌机-用NaOH调节溶液的pH至8.0，然后定容至1000mL。7、杂交缓冲液配置2ml杂交缓冲液于2ml离心管中，各试剂的加入顺序：360L 5M NaCl；40L 1MTrisHClxL 100甲酰胺（见下表）yL 无菌水（见下表）2L 10SDS0.22m孔径的滤膜过滤，4保存。表1 配置不同甲酰胺杂交液中甲酰胺和无菌水

5、的体积甲酰胺浓度（%）甲酰胺体积x（L）无菌水体积y（L）0015985100149810200139815300129820400119825500109830600998357008984080079845900698501000598551100498（甲酰胺有剧毒，操作时需戴手套，在通风处内进行，废液需要回收）不同甲酰胺杂交液的配制甲酰胺浓度（%）5M NaCl溶液（mL）1M Tris-HCl(mL10% SDS(mL甲酰胺体积x（mL）无菌水体积y（mL）207280.480239.6357280.4140179.6407280.4160159.6557280.422099.68、

6、杂交后洗涤液的配置配制50mL杂交洗涤液于50mL离心管中，各试剂加入的顺序如下：Z L 5M NaCl1mL 1MTris-HCl(pH7.6无菌水加至50mL50L 10SDS500L EDTA表2 根据杂交缓冲液中甲酰胺浓度而定的探针清洗液液中NaCl体积数甲酰胺浓度%NaCl体积z（L）NaCl最终浓度（mM）090009005640064010460046015328032820225022525159015930112011235800804056056454004050280285520020不同甲酰胺对应的洗涤液的配制甲酰胺浓度（%）1M Tris-HCl(mL10% SDS(

7、mL0.5M EDTA（mL）5M NaCl溶液（mL）无菌水体积（mL）2080.4418369.63580.446.4381.24080.444.48383.125580.441.63869、4',6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI 常备：1 mg µl-1 需要稀释为：1 µg µl-1灭菌储存在-20 (用铝箔覆盖管子DAPI可诱变致癌，所以在使用时要戴手套并且收集废液，包括早使用移液管时。为了避免使用时对溶液造成污染，所有的溶液应取出置于50ml管中，够每天使用的量。三、实验步骤：1、玻片的

8、预处理：（1）玻片预处理1）玻片清洗：载玻片与盖玻片用热肥皂水刷洗干净，在实验室可用超声清洗代替刷洗（45次 每次10 min），然后用清水浸泡过夜；2）硅化处理：第二天换用1%的盐酸浸泡24小时，然后用蒸馏水清洗干净后放入高压灭菌锅灭菌，60°C烘干。盖玻片用锡纸包好4°C保存备用。（盖玻片干净即可，不用处理）(2黏附剂涂片制备载玻片放入APES与丙酮的1:50溶液（现配现用）中约1min，取出用高压灭菌处理过的蒸馏水清洗后于室温下干燥（也可放入烘箱里25°C烘干），然后置4保存备用2、荧光探针的选择和标记（见fish探针的选择表）3、样品的制备与固定（1）用已

9、灭菌的聚乙烯取样管取反应器内泥水混合液1mL，加适量灭菌蒸馏水振荡混匀，并用超声波处理使细菌分散。取处理后的悬浊液约 0.5ml进行后续处理。（2）将悬浊液混合均匀后，按1:1加入4%多聚甲醛，于4固定24小时，（3）然后置于12000r/min离心5min去除固定剂，将固定样本加入1ml 0.0lmol/L PBS以10000r/min的速度离心漂洗两次，弃去上清液。（4）采用PBS与乙醇的1:1溶液稀释定容至1ml于20保存备用4、样品的预处理（1）用微型振荡器将样品混合均匀，取10l样品在载玻片上涂抹20mm×20mm大小（不要太大），37的烘箱热固定2h，最高温度不超过60（

10、2）风干后于50、80、95的乙醇中各脱水3min，自然风干。（脱水：准备三个瓷盘，然后将载玻片取出依次放入瓷盘中，用50%乙醇淹没载玻片，脱水3min，取出放入第二、三个瓷盘，然后用80%乙醇脱水，96%乙醇脱水。脱水后的80%、96%乙醇回收。）脱水后的玻片可以在室温下保存几个月，可在-20的条件下保存几个月5、原位杂交探针浓度为50ng/L，在密闭的杂交盒内铺满吸水纸（经高压灭菌烘干），用杂交液湿润，使杂交环境保持一定的湿度。用移液枪分别取24L的杂交液和1L探针滴入带有样品的载玻片上（均匀覆盖涂片面积），（加盖硅化盖玻片，不用）放入杂交盒内进行杂交反应。杂交温度与杂交时间如下。所有有关

11、探针的操作在处理时都应避光处理！探针种类温度（）时间（h）甲酰胺浓度%备注EUB MIX46520同步染色法AOB MIX 46355重复染色法NOB MIX 46540重复染色法GAO MIX462.530同步染色法HGC69a462.530同步染色法PAO651462.530同步染色法6、杂交后洗涤从恒温箱中取出玻片之前将盛有清洗液的容器放入到48的水浴中预热20分钟。杂交完成后取出玻片，立即放入到预热好的容器中。注意不能让玻片干燥，不然将很难洗去非特异性结合的信号，增加背景染色。清洗液的量应当淹没玻片，清洗1520分钟后取出，用清水洗去剩余的清洗液，然后室温下晾干。7、DAPI染色每个玻

12、片用10L DAPI（用甲醇稀释至1g/L）滴加到载玻片样品上，在冰上染色10min，用水冲洗多次，室温下自然晾干，镜检前加盖盖玻片。8、荧光显微镜观察经过以上处理的样品，用荧光显微镜进行观察。探针目标菌群探针序列甲酰胺浓度修饰EUB338Domain BacteriaGCTGCCTCCCGTAGGAGT20%HEXNSO190Ammonia-oxidizing bacteriaCGATCCCCTGCTTTTCTCC55%HEXNIT3Nitrite-oxidizing bacteriaCCTGTGCTCCATGCTCCG40%FITCcNIT3bCCTGTGCTCCAGGCTCCGGAOQ9

13、89CompetibacterTTCCCCGGATGTCAAGGC35%Cy5TMHGC69aActinobacteriaTATAGTTACCACCGCCGT25%FITCPAO651AccumulibacterCCCTCTGCCAAACTCCAG35%Cy3TMDenitrifierCGGGAGGCAGCAGT35%FAM注：a探针浓度均为50ng/L；bcNIT3为硝酸菌探针NIT3的竞争探针。Abbreviationmaximum absorptionMaximum emissionFilter setFITC（绿色）492nm528nm10(Zeiss DAPI（蓝色）365 nm418 nm02(ZeissCY3（橙色/红色）554 nm570 nm15(ZeissCY5（红外线检测） 650 nm667 nm26(Zeiss HEX探针的选用选用EUB MIX(EUB338、EUB338、EUB338来检测活性污泥中的全部的细菌。选用PAOMIX来检测活性污泥中的聚磷菌，选用AOB MIX NOBMIX来检测活性污泥中的硝化菌。选用GAOMIX探针来检测活性污泥中的聚糖菌，选用HGC69a探针来检测反硝化聚磷菌的优势菌种Actinobacteria，用PAO651来检测优势菌种Rhodocyclus，杂交后用4¢