部分液体通气肺组织病理学变化的实验研究

1、部分液体通气肺组织病理学变化的实验研究暨南大学附属第一医院麻醉科 510630 段善娥 孙婵中文摘要目的：从组织病理学方面观察以氟碳（PFC）为媒介的部分液体通气（PLV） 对急性肺损伤（ALI）家猪肺病变的影响。方法：16只体重为23+2kg的健康家猪，随机分为对照组（n=8）和PLV组（n=8），参照Lachmann所述的肺灌洗（lung lavage）方法建立ALI模型，对照组以呼吸机行常规机械通气4 h；PLV组经气管内灌注30 ml /kg氧合的FC-77，并以与对照组相同的呼吸参数行机械通气4h，期间经气管导管持续滴入FC-77，滴注速度以维持呼气末气管导管近心端可见PFC液面为准

2、。实验结束后处死动物，于呼气末夹闭气管导管，取出肺脏。分别取右上前（A）、右上后（B）、右下前（C）、右下后（D）、左上前（E）、左上后（F）、左下前（G）和左下后（H）等部位少量肺组织，福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片后行HE染色，由同一个实验者在光镜下观察以下项目：（1）间质水肿；（2）血管周围水肿；（3）肺泡水肿；（4）间质充血；（5）肺泡内出血；（6）中性粒细胞堆积。根据各组织学特征的严重程度分为四个等级：0=正常，1=轻微，2=中等程度，3=严重。另于左、右肺的中部各取少量组织，戊二醛固定，环氧树脂812包埋，超薄切片机超薄切片，醋酸铀枸橼酸铅染色，在电镜下进行观察。结果：PLV组的

3、总体肺损伤积分、各个组织学特征积分以及PLV组各个区域积分均明显低于对照组；PLV组内上肺积分高于下肺，其余各个区域间积分无显著性差异；对照组组内背侧肺积分明显高于腹侧肺，左肺积分高于右肺。结论：以PFC为媒介的PLV能明显改善ALI动物肺部病理改变。关键词：急性呼吸窘迫综合征；急性肺损伤；部分液体通气；氟碳 。The study of histopathologic changes in experimental lung injury with partial liquid ventilationAbstractObjective: To investigate the histopath

4、ologic effect of partial liquid ventilation（PLV） with perfluorocarbons（PFC） in piglets of acute lung injury（ALI）.Mothods:16 healthy piglets weighting 23+ 2kg were randomly divided into control group (n=8) and PLV group (n=8). The animals were tracheotomized and mechanically ventilated with oxygen (F

5、iO2=1.0). At that time point the parameters of gas exchange and hemodynamics were measured as Baseline. Acute lung injury (ALI) were induced by lung lavage according to Lachmann,. All piglets were surfactant-depleted by lung lavage using 37ºC、40 ml/kg of 9 g/L NaCl until PaO2<100mmHg for one

6、 hour. Conventional mechanical ventilation was administered in control group; PLV group received doses of 30 ml/kg FC-77 and were administered the same respiratory parameters as the control group for four hours. FC-77 was continued dropping via tracheal tube to surport the evaporation of FC-77 durin

7、g therapy.All piglets were killed by injecting 10 milliliter 10% potassium chloride after the experiment, the lungs were taken out after clamping the endotracheal catheter at the end of expiration. 8 hematoxylin-and-eosin-stained sections from each piglet ( ventral and dorsal specimens from the uppe

8、r and lower parts of the right and left lungs ) were examined by the same experimenter for 6 different histologic features under light microscope :（1）interstitial edema; (2) perivascular edema; (3) intra-alveolar edema; (4) interstitial hyperemia; (5) intra-alveolar hemorrhage; (6) neutrophil accumu

9、lation. These characteristics were subjectively scored on a scale from 0 to 3: 0 = normal, 1 = slight effect, 2 = moderate presence of that feature, 3 = severe effect. Then 2 uranil acetee and plumbum medicinal citronate stained sections from each piglet ( central specimens of the right and left lun

10、gs ) were observed under electron microscope.Result:The score was reduced in the partial liquid ventilation-treated animals, compared with the gas-ventilated animals ; the scores of all histologic features and the scores of all regions were reduced in the partial liquid ventilation group, compared w

11、ith the gas-ventilated group; Regional analysis demonstrated a higher score for gas-ventilated group in the dorsal regions of the lungs than that in the ventral regions of the lungs and a higher score for gas-ventilated group in the left regions than that in the right regions ; Comparison of upper a

12、nd lower scores revealed notably decreased scores for upper regions in the partial liquid ventilation animals.Conclusion:PLV with PFC is associated with a reduction in the histopathological changes observed in piglets lungs of ALI.Key Words:Acute respiratory distress syndrome; Acute lung injury; Par

13、tial liquid ventilation; Perfluorocarbon .前言急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由于肺外或者肺内的严重疾病引起肺毛细血管炎症性损伤，通透性增加，继发急性高通透性肺水肿和进行性缺氧性呼吸衰竭，临床表现均为急性呼吸窘迫，难治性低氧血症。1967年 Ashbaugh等1 报导在12例患者（7例严重创伤、1例急性胰腺炎、1例病毒性肺炎、1例格林-巴氏综合征合并肺炎、2例药物中毒合并误吸）发现了相同的一组征候群，临床表现为严重呼吸困难、气促、紫疳，吸氧后症状无改善，其肺顺应性明显下降，X光片显

14、示双肺弥漫性间质浸润。报导将该症候群命名为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome , ARDS)。在其后的报导中，为了和新生儿或婴儿呼吸窘迫综合征相区别, 亦使用“成人呼吸窘迫综合征”（adult respiratory distress syndrome，ARDS）的概念。但因本征亦发生在儿童青少年，1994年欧美急性呼吸窘迫综合征联席会议(The American-European Consensus Conference on ARDS, AECC)建议统一采用急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress s

15、yndrome , ARDS)的名称2。同时，急性肺损伤(acute lung injury, ALI)也被定义。在数十年的研究中，有关ARDS的定义及诊断一直无统一的标准，为该病的研究及临床治疗造成一定的影响。为此，1994年AECC推荐诊断ALI标准为： 急性起病；低氧血症，动脉氧分压（arterial partial press of oxygen，PaO2）与吸入氧浓度（inspiratory oxygen fraction，FiO2）之比，即PaO2FiO2300 mm Hg；胸片显示双肺浸润阴影；肺毛细血管锲嵌压(pulmonary capillary wedge pressure

16、，PCWP)18 mm Hg，或临床除外心源性因素。ALI和ARDS的区别为低氧血症的程度2 ，ARDS的诊断标准为：PaO2FiO2 200 mm Hg，其他标准同ALI。ARDS是急性肺损伤（acute lung injury，ALI）发展到后期的典型表现，ALI代表早期的阶段。ARDS病因尚未阐明，与之相关的疾病包括严重休克、严重感染（败血症、肺炎等）、严重创伤、弥散性血管内凝血（DIC）、吸入刺激性气体或胃内容物、溺水、大量输血、急性胰腺炎、药物或麻醉品中毒、骨折时脂肪栓塞、氧中毒等。3总的来说，ARDS的发病机制尚不清楚，在早期（ALI）阶段是全身性炎症反应过程的一部分。肺损伤的过程

17、除与基础疾病的直接损伤有关外，更重要的是炎症细胞及其释放的介质和细胞因子的作用。最终引起肺毛细血管损伤，通透性增加和微血栓形成；肺上皮损伤，表面活性物质减少或消失，导致肺水肿，肺内透明膜形成和微肺不张，从而引起肺的氧合功能障碍，导致顽固性低氧血症。世界范围内的ARDS发病率估计为每年213/10万。ARDS的诊断标准不断改善，研究时采用的诊断标准可能不同，并且还有研究设计和研究人群的差异，因此各研究报道的发病率有所差别。Webster等（1988）报道英国的ARDS发病率为每年4.5/10万；Villar 和Slutsky(1989)研究显示西班牙的ARDS发病率为每年1.53.5/10万；L

18、ewandowski等（1995）报道德国的发病率为每年3.0/10万；Thomen和Morri（1995）报道美国犹他州的ARDS发病率为每年4.88.3/10万；Luhr等（1999）报道了斯堪的纳维亚人口ARDS发病率为每年13.5/10万；Iribarren等（2000）报道了美国的ARDS发病率为每年4.6/10万。470年代ARDS的病死率高达80%，随着人们对ARDS认识及其监护技术的进步，特别是感染控制、肠道营养、肺保护性性通气策略的应用，ARDS的病死率逐渐下降，目前ARDS的死亡率在30%60%之间(见表1)。4表1 ARDS死亡率 研究者发表年份（年）病人（例）死亡率Le

19、wandowski等19951750%Milberg等199526441%Doyle等19955758%Dirusso等19956730%Zilerberg和Epsrein19958158%Ferring和Vincent199712952%Croce等199917840%Luhr等199922141%ARDS的主要病理改变是肺广泛性充血水肿和肺泡内透明膜形成。病理过程可分成三个阶段：渗出期、增生期和纤维化期。大体上，ARDS肺呈暗红或者暗紫红的肝样变，可见水肿、出血，重量明显增加，切面有液体渗出，镜下可见肺微血管充血、出血、微血栓，肺间质和肺泡内有蛋白质水肿液及炎细胞浸润。约经72小时后，由凝

20、结的血浆蛋白、细胞碎片、纤维素及残余肺表面活性物质混合形成透明膜，伴灶性或大片肺泡萎陷。可见型泡上皮受损坏死，经过13周后，逐渐过渡到增生期和纤维化期。可见型肺泡上皮、成纤维细胞增生和胶原沉积。部分肺泡的透明膜经吸收消散而修复；亦可有部分形成纤维化。ARDS患者容易合并肺部继发感染，可形成肺小脓肿等炎症的改变。3 由于肺毛细血管内皮细胞和肺泡型细胞的受损，引起肺间质和肺泡水肿、充血、肺表面活性物质减少，导致小气道陷闭、肺泡萎陷不张，肺顺应性降低，功能残气量减少，从而使通气/血流比例失调、肺内动静脉样分流增加和弥散障碍，造成换气功能严重损害和低氧血症，刺激颈动脉窦主动脉体化学感受器可反射刺激呼吸

21、中枢产生过度通气，出现呼吸性碱中毒。在ARDS晚期，由于病情严重，呼吸肌疲劳衰竭，发生通气不足，缺氧更为严重，伴二氧化碳潴留，形成混合性酸中毒。ARDS的治疗包括改善换气功能及氧疗，纠正缺氧，并要及时去除病因，使原发病得到控制。目前危重医学上倾向于将ARDS视为多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的一个组成部分。因此，早期发现和及时治疗非常重要，对脓毒血症、严重创伤、急性胰腺炎、误吸等高危人群加强监护，控制感染，定期分析血气，改善通气和组织供氧，防止肺损伤进一步发展。目前常用的治疗手段有：一、 机械通气机械通气是目前ARDS

22、最重要且无可替代的治疗手段之一。过去很多年，人们一直把维持足够的潮气量（tidal volume，TV）以摄入O2、排出CO2来维护PaO2和PaCO2于正常水平作为操作通气机的金科玉律，ARDS机械通气基本采用容量控制呼吸加呼气末正压（positive end-expiratory pressure，PEEP）通气模式结合吸入高浓度的氧气，潮气量设置通常为10-15ml/kg，PEEP高达25cmH2O,以“吹开”和重新开启在ARDS时萎陷的肺泡以提高通气/血流比例、危及生命的低氧血症为施行机械通气的首要目的，结果是带来了有功能肺泡的气压伤（barotrauma）和容积伤(volutraum

23、a)，或统称为“与通气机有关的肺损伤”（ventilatorassociated lung injure,VALI）59。由于ARDS病人残存的有通气功能的肺泡已大为减少，只有正常肺的2030%，与婴儿相当，因此1990年有人提出了婴儿肺（baby lung）的概念9。“婴儿肺”新概念的提出使人们对某些应用机械通气治疗而病情反加剧的原因进行反思，认识到若将肺泡正常时的机械通气潮气量 (1015 ml /kg) 施加到通气容量已明显降低的ARDS患者，必将造成通气肺泡的过度扩张。二、 肺保护性通气策略（lung-protective ventilation strategies, LPVS）一系

24、列的动物实验结果显示，过度牵拉肺泡上皮细胞时，一方面可明显上调肺内炎症细胞及有关介质，另一方面功能残气量（functional residual capacity, FRC）已极度减少的萎陷或不张的肺泡在较大正压通气下，必将反复发生开放、萎陷过程，对萎陷肺泡施加的潮气量越大，所造成的肺泡吸、呼之间的剪切力亦越大，是肺泡气压伤和容积伤的重要物理原因。气体通过肺泡损伤部位泄漏，可导致气胸、肺间质气肿和系统性气体栓塞等并发症10 。此外，机械通气所致毛细血管压力衰竭(capillary stress failure)亦可使毛细血管通透性增加，加重肺水肿程度。高浓度氧也是导致肺泡上皮细胞变性、水肿和纤

25、维渗出的原因。上述认识，促使了机械通气方式改进及“肺保护性通气策略”的提出。LPVS包括低潮气量(4-8ml/kg)，个体化最佳PEEP（保持呼气末萎陷肺泡扩张的最小PEEP值），低呼气峰压（小于35 cmH2O），降低吸入氧浓度（小于0.60）和允许性高碳酸血症（permissive hypercapnia, PHC）等。有学者认为，PaO27，11，12，13。美国国立卫生研究院于1994年开始将10个医学中心的24所医院组成研究组，对小潮气量通气（6 ml /kg）与传统通气潮气量（12 ml /kg）进行前瞻性随机性对照实验，从完成的861例临床实验结果统计，小潮气量组（432例）比传

26、统潮气量组（429例）的死亡率降低了22%13。近年来国内外还出现了一些新的疗法：三、 俯卧位通气（prone position ventilation ） 目前，在传统机械通气显得不足时，首先推荐改用俯卧。Albert14等应用CT对仰卧和俯卧体位下机械通气进行多层面对比性扫描，结果表明：俯卧位可减轻心脏对肺的压迫。仰卧位时左右肺容量分别减少7 %和11 %，而俯卧位时则分别减少1 %和4 %，此外俯卧位还可改变肺背侧的经肺压力，包括实变肺的压迫、腹内容物对背侧肺的直接压迫，以及心脏重量对肺的直接影响等。ARDS病人改变体位采用俯卧位，可使背侧不张肺复张，从而改善背侧病变肺血流和通气，增加肺

27、通气和氧合。四、 一氧化氮（nitric oxide ，NO）吸入 1991年FALKE首次报道应用NO治疗重度ARDS取得成功，随后相继证明吸入NO后可降低肺血管阻力，减少肺内分流，提高氧合作用。由于NO具有选择性扩张有通气区域的肺血管，从而改善通气/灌注比值，提高ARDS肺氧合。近期还发现NO可降低肺泡液中IL-1和IL-8的含量，抑制ARDS肺部的过度炎症反应。NO进入血循环后迅速与血红蛋白结合而灭活，对体循环无影响，故对ARDS治疗安全有效。一般剂量为15 ppm。五、 体外循环膜肺氧合（extracorporeal membrane oxygenation, ECMO）即在体外通过膜

28、式氧合器进行气体交换。体外气体交换有两个目的：一、维持所需的血气值，避免肺功能不全引起的死亡；二、避免持续性肺损害，使肺得到休息。六、 表面活性物质替代疗法（surfactant replacement）表面活性物质由肺泡型上皮细胞分泌，当其缺乏或者功能障碍时，均可导致肺泡萎陷，通气/血流失衡。表面活性物质替代疗法在新生儿中有很好的治疗记录，而在成人的效果则有争议。七、 免疫治疗针对ARDS病人体内促炎细胞因子和多种炎症介质呈失控性释放的病变特点，通过基因工程和分子生物学方法合成细胞因子抗体、IL-1受体拮抗剂、TNF受体拮抗剂。八、 持续肾置换治疗（continuous renal repl

29、acement therapy, CRRT） 通过血液透析过滤以排除循环内细菌毒素和炎性介质（如TNF、IL-1等）。九、 其他包括皮质类固醇、脂质体PGE1、TXA2合成酶抑制剂等十、 液体通气(liquid ventilation, LV) 液体通气是近几十年来发展起来的一种完全不同于传统机械通气的治疗ARDS的手段：向气管内滴入氟碳液（perfluorocarbon，PFC），使之完全或者部分代替空气进行呼吸。PFC有较高的携氧和二氧化碳能力，是较理想的肺内气体交换媒介。1922年Neergaard15的研究提示，扩张一个充盈程度相同的肺泡，以气体充盈者所需的压力是以液体充盈者的三倍，该

30、研究为液体通气提供了理论依据。1962年Kylstra及其同事16发表了鼠似鱼的文章，他们把小鼠放入高压生理盐水中，由于高压盐水溶解了足够的氧气，小鼠在高压盐水中存活了几分钟，最后死于呼吸性酸中毒。但研究显示了哺乳动物可以在液体媒介中呼吸，首次提出了LV的概念。生理盐水对氧的溶解度极低，实验需在8个大气压的高压氧仓中进行，其实用价值不大。因此，只有找到一种能在常压下溶解大量呼吸气体的液体，才能在实际中应用液体通气。具有这种特性的液体只有硅油(silicone oils)和PFC。1966年Clark等17在Science上报导了小鼠在PFC中可以完成气体交换，他们把小哺乳动物完全浸入硅油和PF

31、C中，实验证明硅油对动物有毒性，而PFC是一种理想的液体媒介。PFC属于生物惰性化合物，特性为表面张力低、密度高和对呼吸气体可溶性高。几种常用PFC理化性质与水比较见下表2。LV可分为全液体通气（total liquid ventilation, TLV）和部分液体通气（partial liquid ventilation, PLV）两种。全液体通气是最早用于动物实验的液体通气方式。其原理是体外的膜氧合器使PFC充分溶解O2和排除CO2，并用流量限制时间切换的液体通气机，将经过氧合的PFC送入肺内，呼气时PFC流出并带出体内CO2，由此完成气体交换，一般频率为36次/分。由于此方法使整个呼吸道

32、和肺部充满往返流动的液体，故称为TLV。Greenspan等1819 首先应用TLV治疗早产儿急性呼吸衰竭，结果PaO2、动脉血二氧化碳分压（arterial partial pressure of carbon dioxide, PaCO2）、肺顺应性及肺阻力等均获明显改善。TLV因设备昂贵，操作复杂，使其研究和临床应用受到限制。PLV是先经气管向肺内注入相当于或低于正常功能残气量的PFC（30 ml /kg），随后进行常规通气。1991年，Fuhrman等20首次在13只健康小猪成功地实施了以PFC为媒介的部分液体通气。该方法实施简单，能有效维持实验动物肺气体交换，不需额外的设备，并成功地

33、将液体通气与气体通气相结合，大大简化了LV治疗模式，为大多数研究者所接受。1993年，Tutuncu等21首次将PLV用于ALI动物的治疗，证明了PLV治疗ALI是可行和有效的。八十年代初Katzenstein和Askin首先提出了“弥漫性肺损伤（diffuse alveolar damage，DAD）”的概念来描述由非心源性的肺损伤引起的组织学发现，并采用了“肺损伤积分（diffuse alveolar damage score）法”对急性呼吸窘迫综合症的肺显微结构的病理改变进行研究23，该方法与Anderson和Thielen24曾经描述过的积分方法相似，并增加了一些研究特征。这种积分法对

34、不同的组织学特征根据其严重程度进行积分，量化了肺的组织学损伤程度。本实验拟在肺灌洗诱导的ALI家猪实施以PFC为媒介的PLV，以肺损伤积分法进行评分，从病理组织学方面探讨其对ARDS治疗的机理和可行性，为今后PLV用于ALI或ARDS临床治疗积累经验。表2 几种常用PFC理化性质与水比较水FC-3280FC-77Perflubron分子式H2OC8F18C8F16OC8F17Br沸点(ºC)10010297143密度25ºC (kg/m3)1.01.761.781.93蒸气压 37ºC (mmHg)47518511表面张力 25ºC(dynes/cm3)

35、75151518O2溶解度 25ºC(ml/100ml)3405653CO2溶解度25ºC(ml/100ml)55192198210资料与方法一、实验动物16只健康家猪，体重为23+2kg。二、实验仪器 呼吸机：型号Achieva PSO2，美国BP公司。监护仪：型号Solar8000，美国GE公司。血气分析仪：型号RS232C，澳大利亚Graz公司。血常规分析仪：型号SF-3000，广州信宏科贸有限公司。 光学显微镜：型号，BX40，日本Olympus公司透射电镜：型号TECNAI-10TEM，荷兰飞利普公司。三、实验药品FC-77：美国3M公司。阿托品：广东邦民制药厂有

36、限公司。氯胺酮：山东方明药业股份有限公司。硫喷妥钠：上海新亚药业有限公司阿曲库铵：江苏恒瑞医药股份有限公司。芬太尼：宜昌人福药业有限责任公司。生理盐水：广州神州制药有限公司。四、实验方法1. 实验动物的准备麻醉前，肌肉注射阿托品0.01 mg /kg，氯胺酮10 mg /kg，待动物入睡后，开放耳缘静脉，静注硫喷妥钠5 mg /kg、阿曲库铵0.6 mg /kg，行气管插管。麻醉维持：持续静脉泵入硫喷妥钠0.2 mg·kg-1·min-1、芬太尼1µg·kg-1·min-1及阿曲库铵20µg·kg-1·min-1。

37、然后将动物置于仰卧位后行气管切开，置入8.08.5号气管导管，行常规机械通气。分离右侧颈内动脉和颈内静脉，颈内动脉置入动脉穿刺针，颈内静脉置入漂浮导管（7Fr Arrow，德国）。2. 呼吸机参数设定对照组和PLV组呼吸机参数设定相同。呼吸频率 (respiratory rate, RR) 设置为16次/min，潮气量 (tidal volume, TV) 12 ml/kg，维持呼吸末CO2 （expiration carbon dioxide pressure, PETO2）为3540 mmHg，吸入氧浓度（inspired oxygen fraction, FiO2）1.0，呼吸末正压(p

38、ositive end-expiratory pressure, PEEP)5 cmH2O，吸呼比(inspiratory : expiratory, I:E)为1:2。3. 监测指标所有动物持续监测心电图、心率（heart rate, HR），脉搏血氧饱和度(pulse oxyghemoglobin saturation，SpO2)，呼吸末二氧化碳分压(expiration carbon dioxide pressure，PETCO2)。颈内动脉持续监测平均动脉压(mean arterial press, MAP)，颈内静脉肺动脉导管监测中心静脉压(central venous pressu

39、re, CVP)、平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure, MPAP)、肺毛细血管嵌压(pulmonary capillary wedge pressure, PCWP)。上述操作完成后记录各参数并抽取动脉、中心静脉和肺动脉血进行血气分析和血常规检测，此时为基础值（Baseline）。4动物模型制作肺灌洗诱导的急性肺损伤动物模型的建立参照Lachmann等描述的方法22。将动物置于约45度头高脚低位，经气管内灌入37ºC、40 ml /kg的生理盐水，停留数秒后置于脚高头低位，放出生理盐水，5 min后重复操作。自第二次肺灌洗后行血气分析，重复

40、以上操作，直至PaO2<100 mmHg，并维持1 h，此时即为ALI。5分组所有动物ALI后随机分为对照组（n=8）和PLV组（n=9）。对照组ALI行常规机械通气4 h；PLV组经气管内注入37ºC、氧合的FC-77，灌注量为30 ml /kg，期间经气管导管连接接头处持续滴入FC-77，滴注速度以维持呼气末气管导管近心端可见PFC液面为准，然后以与对照组相同的呼吸参数行机械通气4 h。6数据采集及计算两组动物ALI后均观察4小时，需要记录的时间点为Baseline、ALI、1 h、2 h、3 h、4 h，分别记录心率HR、MAP、MPAP、CVP、PCWP等，并记录动脉、

41、静脉及混合静脉血气、血常规分析结果PH、PaO2、动脉血二氧化碳分压（arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2）、动脉血氧饱和度（arterial oxyghemoglobin saturation, SaO2 ）、混合静脉血氧饱和度（mixed venous oxyghemoglobin saturation，SvO2）、混合静脉血氧分压（mixed venous partial pressure of oxygen, PvO2）、混合静脉血二氧化碳分压（mixed venous partial pressure of carbon

42、dioxide, PvCO2）、血红蛋白（hemoglobin, Hb）等数据。实验结束后深麻醉下静脉注射10%氯化钾10ml处死动物，于呼气末夹闭气管导管，取出肺脏。观察大体标本病变情况，分别取右上前（A）、右上后（B）、右下前（C）、右下后（D）、左上前（E）、左上后（F）、左下前（G）和左下后（H）等部位少量肺组织，福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片后行HE染色，由同一个实验者在光镜下观察以下组织学特征：（1）间质水肿；（2）血管周围水肿；（3）肺泡水肿；（4）间质充血；（5）肺泡内出血；（6）中性粒细胞堆积，并根据各组织学特征的严重程度分为四个等级：0=正常，1=轻微，2=中等程度，3=

43、严重25。另于左右肺中部各取少量组织，戊二醛固定，环氧树脂包埋，超薄切片机超薄切片，醋酸铀染色，在电镜下进行观察。五、统计学处理所有计数资料以频数表示，用SPSS12.0统计软件包进行分析，两组间比较采用两独立样本秩和检验（Two-Independent-Sampls Test ）,P < 0.05为差异有显著性。实验结果一、 观察项目的积分结果及比较所有积分结果以频数表表示，统计结果以平均秩（Mean Rank）和双侧渐近概率（Asymp.Sig.(2-tailed)）P表示。16只实验动物全部存活到实验结束。（一）积分计算方法：1. 每一个取材点的六个组织学特征的每一个等级的频数之和

44、等于该取材点该等级的频数；2. 个体的每个等级的频数等于每个取材点的该等级的频数之和；3. 两组总体的每个等级的频数分别等于各个体的该等级的频数之和；4. 区域：腹侧肺=A+C+E+G，背侧肺=B+D+F+H；右肺=A+B+C+D，左肺E+F+G+H；上肺=A+B+E+F，下肺=C+D+G+H。各区域的每个个体等级的频数等于该区域每个取材点的该等级频数之和，各区域的总体的每个等级的频数分别等于各个体该区域该等级的频数之和。（二）比较方法：1. 两组总体积分比较；2. 按区域积分进行组内比较和组间比较；3. 按组织学特征积分进行组间比较。（三）统计结果1. PLV组的总体肺损伤积分明显低于对照组

45、，见表3 ；2. PLV组组内上肺积分明显低于下肺，左肺与右肺、背侧肺与腹侧肺之间积分无显著性差异，见表4；3. 对照组组内背侧肺积分明显高于腹侧肺，左肺积分高于右肺，上肺与下肺积分无显著性差异，见表5；4. PLV组各个组织学特征积分均明显低于对照组；见表6；5. PLV组各个区域积分均明显低于对照组相应区域，见表7。表3 两组间总体肺积分结果积分PLV组对照组0238431144169221243048合计384384统计结果：PLV组平均秩（Mean Rank ）= 255.07，对照组平均秩 = 513.93，双侧渐近概率 （Asymp.Sig.(2-tailed)）P < 0.

46、0005 。表4.1 PLV组背、腹侧肺积分结果积分腹侧肺背侧肺012811016381211300合计192192统计结果：PLV组背侧肺平均秩 = 201.45，腹侧肺平均秩 = 183.55，双侧渐近概率 P = 0.061 > 0.05。表4.2 PLV组左、右肺积分结果积分左肺右肺011312517767220300合计192192统计结果：PLV组左肺平均秩 = 198.85，右肺平均秩 = 186.15，双侧渐近概率 P = 0.183 > 0.05。表4.3 PLV组上、下肺积分结果积分上肺下肺013510315589220300合计192192统计结果：PLV组上

47、肺平均秩 = 176.96，下肺平均秩 = 208.04，双侧渐近概率 P = 0.001 < 0.05。表5.1 对照组背、腹侧肺积分结果积分腹侧肺背侧肺0358110465248763543合计192192统计结果：对照组背侧肺平均秩 = 233.64，腹侧肺平均秩 = 151.36，双侧渐近概率 P < 0.0005。表5.2 对照组左、右肺积分结果积分左肺右肺01429177922655933612合计192192统计结果：对照组左肺平均秩 = 213.46，右肺平均秩 = 171.54，双侧渐近概率 P < 0.0005。表5.3 对照组上、下肺积分结果积分上肺下肺

48、02518190792556932226合计192192统计结果：对照组上肺平均秩 =182.80 ，下肺平均秩 = 202.20，双侧渐近概率 P = 0.068 > 0.0005。表6.1 两组间间质水肿积分结果积分PLV组对照组0381126262028309合计6464统计结果：PLV组平均秩 = 38.48，对照组平均秩 = 90.52，双侧渐近概率 P < 0.0005 。表6.2 两组间血管周围水肿积分结果积分PLV组对照组0374127342019307合计6464统计结果：PLV组平均秩 = 42.52 ，对照组平均秩 = 86.48，双侧渐近概率 P <

49、0.0005 。表6.3 两组肺泡水肿积分结果积分PLV组对照组0611313332014304合计6464统计结果：PLV组平均秩 = 40.08 ，对照组平均秩 = 88.92，双侧渐近概率 P < 0.0005 。表6.4 两组间间质充血积分结果积分PLV组对照组01411492321303010合计6464统计结果：PLV组平均秩 = 42.79，对照组平均秩 = 86.21，双侧渐近概率 P < 0.0005 。表6.5 两组间肺泡内出血积分结果积分PLV组对照组059231523209309合计6464统计结果：PLV组平均秩 = 45.80，对照组平均秩 = 83.2

50、0 ，双侧渐近概率 P < 0.0005 。表6.6 两组间中性粒细胞堆积积分结果积分PLV组对照组02811353021233010合计6464统计结果：PLV组平均秩 = 42.13，对照组平均秩 = 86.87，双侧渐近概率 P < 0.0005 。表7.1 两组间背侧肺积分结果积分PLV组对照组011081816521763043合计192192统计结果：PLV组平均秩 = 116.46，对照组平均秩 = 268.54 ，双侧渐近概率 P < 0.0005 。表7.2 两组间腹侧肺积分结果积分PLV组对照组0128361631042148305合计192192统计结果

51、：PLV组平均秩 = 138.23 ，对照组平均秩 = 247.49，双侧渐近概率 P < 0.0005 。表7.3 两组间左肺积分结果积分PLV组对照组0113141777722653036合计192192统计结果：PLV组平均秩 = 122.96，对照组平均秩 = 262.04 ，双侧渐近概率 P < 0.0005 。表7.4 两组间右肺积分结果积分PLV组对照组0125291679220593012合计192192统计结果：PLV组平均秩 = 132.11，对照组平均秩 = 252.89，双侧渐近概率 P < 0.0005 。表7.5 两组间上肺积分结果积分PLV组对照

52、组0135251559022553022合计192192统计结果：PLV组平均秩 = 126.83，对照组平均秩 = 258.17 ，双侧渐近概率 P < 0.0005 。表7.6 两组间下肺积分结果积分PLV组对照组0103181897920693026合计192192统计结果：PLV组平均秩 = 127.98，对照组平均秩 = 257.02，双侧渐近概率 P < 0.0005 。二、组织形态学变化1. 从大体标本看，对照组全肺可见白色与暗红的质实斑块相间，背侧可见大片状出血，并可见凹陷的斑片状肺萎陷区；PLV组肺手感重量较大，肺充盈，全肺呈均一的粉红色，背侧可见少量散在出血点。

53、见图（3） PLV组肺 对照组肺 图（3）2. 在光镜下可见，对照组肺泡萎陷呈梅花状，肺间质明显水肿、充血，肺泡水肿、充血严重，毛细血管扩张充血明显，血管周围间质明显水肿，肺泡内可见渗出、出血及炎细胞浸润；PLV 组肺泡大小均匀，间质轻度水肿，毛细血管无扩张充血，肺泡水肿、出血较轻，肺泡内基本未见炎细胞。见图（4） 对照组间质水肿（×400） 对照组肺泡内出血（×400） 对照组肺泡塌陷（×100） 对照组炎细胞渗出（×400） PLV组肺无明显充血渗出（×400） PLV组肺泡扩张（×100）图（4）3. 在电镜下观察，对照组肺泡表

54、面活性物质失去正常的线性表面，出现断裂、脱落入肺泡腔或聚集成块现象，红细胞及炎性细胞渗出到肺泡腔，肺泡型上皮细胞变性、坏死甚至崩解，板层小体空泡化明显；PLV组肺泡表面活性物质层有柔和的线性表面，电镜下呈双相，可清楚见电子密度致密界面层和电子密度较低的下层，肺泡型上皮细胞有部分变性，但无坏死及崩解，板层体空泡化不明显。见图（5） 对照组 PLV组 对照组 PLV组图（5）讨论本实验通过对经肺灌洗诱导的ALI家猪实施以PFC为媒介的PLV治疗，从组织病理学的改变方面来评价PLV对ALI家猪肺的影响。为了评定组织病理学的改变，我们采用了“肺损伤积分法”23, 24进行积分，这种积分能反映ALI或者

55、ARDS的典型的肺急性组织学改变，并能量化改变的严重程度。评分过程由同一个实验者采用盲法进行，最大限度地避免了偏差。由于ALI之后约需经过72小时才可形成透明膜，13周后才能观察到纤维形成3，因此本实验中没有取得这两个组织学特征的统计资料。经肺灌洗诱导的ALI模型主要是通过洗出肺泡表面活性物质（pulmonary surfactant, PS），使呼吸末肺泡萎陷，造成与ARDS相似的肺部病理生理改变，是目前研究ARDS常用的肺损伤动物模型。PS具有维持肺泡表面张力，保持肺泡稳定，防止细胞萎陷，减少肺间质和肺泡内的组织液生成，防止肺水肿的重要作用。PS缺乏和减少是肺损伤最重要的原因之一。1980年Lachmann等22第一次描述了这种模型，并对经肺灌洗诱导ALI模型肺气体交换、呼吸动力和肺组织病理改变与ARDS肺部改变进行了对比和论证，证实该模型的可靠性。Nielsen等26的研究也证实了经肺灌洗诱导的ALI模型在肺损伤方面与ARDS的肺损伤类似，表现为大量肺泡萎陷、肺顺应性下降和肺水肿等，他们观察到维持6小时稳定的肺损伤。我们实验经过310次肺灌洗后，达到PaO2<100 mmHg（FiO2=1.0）ALI模型要求，且肺损伤