第二章生物分离和提取技术

1、第二章第二章 生物产品分离提取技术生物产品分离提取技术 北京化工大学北京化工大学 谭天伟教授谭天伟教授生物产品的分离纯化技术生物产品的分离纯化技术2.1 2.1 生物产品的分离纯化生物产品的分离纯化2.2 2.2 预处理和絮凝技术预处理和絮凝技术2.3 2.3 细胞破碎技术细胞破碎技术2.4 2.4 双水相萃取技术双水相萃取技术2.5 2.5 膨胀床技术膨胀床技术2.6 2.6 膜分离膜分离2.7 2.7 沉淀技术沉淀技术2.1 生物产品的分离纯化技术生物产品的分离纯化技术41、胞外产物、胞外产物 离心或过滤离心或过滤固液分离固液分离转入液相转入液相2、胞内产物：、胞内产物：收集细胞收集细胞细

2、胞破碎或整体细胞萃取细胞破碎或整体细胞萃取目的产物目的产物释放释放转入液相转入液相分离细胞碎片分离细胞碎片3、 产物为细胞产物为细胞 离心或过滤离心或过滤固相干燥固相干燥得到菌体得到菌体分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒（如细胞碎片、分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒（如细胞碎片、核酸以及蛋白质的沉淀物）核酸以及蛋白质的沉淀物）固液分离目的：固液分离目的：2.2 发酵液预处理和絮凝发酵液预处理和絮凝 预处理预处理: : 高价无机离子的去除高价无机离子的去除 蛋白质的去除蛋白质的去除 絮凝絮凝 固液分离技术固液分离技术为什么为什么?7发酵液杂质对分离提取影响最大的是：发酵液杂质对分离提取影响最大的是：高价无

3、机离子和水溶性杂蛋白高价无机离子和水溶性杂蛋白高价无机离子高价无机离子影响离子交换树脂对目标物的吸附影响离子交换树脂对目标物的吸附水溶性杂蛋白水溶性杂蛋白影响离子交换和大网格树脂的吸附能力影响离子交换和大网格树脂的吸附能力有机溶剂提取和双水相萃取时，产生乳化，难以分离有机溶剂提取和双水相萃取时，产生乳化，难以分离在常规过滤或膜过滤时，使滤速下降，污染滤膜在常规过滤或膜过滤时，使滤速下降，污染滤膜8发酵液的特点及预处理发酵液的特点及预处理发酵液的特点：发酵液的特点：1、多为悬浮液，粘度大，不易过滤、多为悬浮液，粘度大，不易过滤2、滤液浑浊、滤速极慢（菌体自溶，核酸、蛋白、滤液浑浊、滤速极慢（菌体

4、自溶，核酸、蛋白 质及其他有机粘性物质）质及其他有机粘性物质）3、目标产物在发酵液中的浓度通常较低；、目标产物在发酵液中的浓度通常较低；4、含有高价无机离子（、含有高价无机离子（Ca2+ , Mg2+, Fe3+ ，成分复，成分复 杂（菌丝体、菌种代谢物和剩余培养基会）杂（菌丝体、菌种代谢物和剩余培养基会）预处理是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤预处理是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤9无机离子的去除无机离子的去除 例如：在四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，例如：在四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，60下下反应生成草酸铅，草酸铅在反应生成草酸铅，草酸铅在9095下用硫酸分解，下用硫

5、酸分解，再经过过滤、冷却、结晶操作后就可以回收草酸。再经过过滤、冷却、结晶操作后就可以回收草酸。1、草酸可酸化发酵液，改变发酵液的胶体状态，有助于、草酸可酸化发酵液，改变发酵液的胶体状态，有助于 产物转入液相。产物转入液相。2、反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液质、反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液质 量。量。3、在沉淀钙离子的同时，草酸还会与发酵液中的镁离子、在沉淀钙离子的同时，草酸还会与发酵液中的镁离子 形成草酸镁，去除部分镁离子。形成草酸镁，去除部分镁离子。4、草酸的价格较高，注意回收利用以降低成本、草酸的价格较高，注意回收利用以降低成本。钙离子的去除钙离子的去除加入

6、草酸或草酸钠加入草酸或草酸钠10镁离子的去除镁离子的去除与镁离子形成可溶性络合物，即可消除对离子与镁离子形成可溶性络合物，即可消除对离子交换树脂的影响：交换树脂的影响：Na5P3O10 + Mg 2+ = MgNa3P3O10 + 2Na+用磷酸盐处理，也能大大降低发酵液中钙离子用磷酸盐处理，也能大大降低发酵液中钙离子和镁离子的浓度。和镁离子的浓度。此法可用于环丝氨酸的提炼。此法可用于环丝氨酸的提炼。加入三聚磷酸钠加入三聚磷酸钠铁离子的去除铁离子的去除使其形成普鲁士兰沉淀使其形成普鲁士兰沉淀3K4Fe(CN)6 + 4Fe 3+ = Fe4Fe(CN)63+ 12K+加入黄血盐加入黄血盐11水

7、溶性蛋白质的特征：水溶性蛋白质的特征：1、以胶体状态存在于发酵液中，其稳定性与所带电荷、以胶体状态存在于发酵液中，其稳定性与所带电荷 有关；有关；2、两性物质，存在等电点，等电点多在酸性范围内。、两性物质，存在等电点，等电点多在酸性范围内。 在酸性溶液中带正电，在碱性溶液中带负电；在酸性溶液中带正电，在碱性溶液中带负电；3、加热易变形，可使溶液粘度降低，加快过滤速度、加热易变形，可使溶液粘度降低，加快过滤速度水溶性蛋白质的去除水溶性蛋白质的去除根据蛋白质的特性，有几种去除方法？根据蛋白质的特性，有几种去除方法？ 发酵液的预处理，从根本上说，是如何使可溶性杂蛋发酵液的预处理，从根本上说，是如何使

8、可溶性杂蛋白形成沉淀，以便随固形物一同除去的过程白形成沉淀，以便随固形物一同除去的过程 12水溶性蛋白质溶液是胶体体系，分子与水有很大的亲水溶性蛋白质溶液是胶体体系，分子与水有很大的亲和力，所以又是亲水胶体。它的溶解度与其分子高度和力，所以又是亲水胶体。它的溶解度与其分子高度水化有关，所以溶解的蛋白质分子周围有水化有关，所以溶解的蛋白质分子周围有水化层水化层。水。水化层是胶体体系稳定的必要条件之一。如果向胶体系化层是胶体体系稳定的必要条件之一。如果向胶体系统中加入电解质，随着体系的离子强度增大，蛋白质统中加入电解质，随着体系的离子强度增大，蛋白质表面的表面的双电层双电层厚度就会降低，静电排斥作

9、用减弱，同厚度就会降低，静电排斥作用减弱，同时也使得蛋白质某些疏水区的水化层脱落，疏水区域时也使得蛋白质某些疏水区的水化层脱落，疏水区域暴露，容易发生凝聚，从而沉淀。水溶液中的蛋白质，暴露，容易发生凝聚，从而沉淀。水溶液中的蛋白质，其溶解度一般在生理离子强度范围内（其溶解度一般在生理离子强度范围内（0.150.2mol/kg）最大，低于或高于此范围时均降低。最大，低于或高于此范围时均降低。1、盐析法、盐析法原理原理131、蛋白质的相对分子量和立体结构，结构不对称的、蛋白质的相对分子量和立体结构，结构不对称的高相对分子量蛋白质所需的盐浓度较低；高相对分子量蛋白质所需的盐浓度较低；2、对于特定的蛋

10、白质，主要影响因素为无机盐的种、对于特定的蛋白质，主要影响因素为无机盐的种类、浓度、温度和类、浓度、温度和pH值。值。 离子半径小而带电荷较多的阴离子的盐析效果比离子半径小而带电荷较多的阴离子的盐析效果比较好，含高价离子比低价型（较好，含高价离子比低价型（1-1）盐的效果好。）盐的效果好。 盐析操作的温度和盐析操作的温度和pH值。值。 高离子强度下，升高温度，蛋白质溶解度降低；高离子强度下，升高温度，蛋白质溶解度降低； pH值在接近蛋白质等电点时，有利于盐析值在接近蛋白质等电点时，有利于盐析 盐的种类，硫酸铵、硫酸钠、氯化钠盐的种类，硫酸铵、硫酸钠、氯化钠影响盐析的主要因素影响盐析的主要因素1

11、42、等电点沉淀法、等电点沉淀法 蛋白质通式：蛋白质通式：RNH2COOH一种两性电解质一种两性电解质 羧酸解离时产生羧酸解离时产生H H+ +，使，使蛋白质具有弱酸性蛋白质具有弱酸性： HRNH2RNH2COOHCOO蛋白质的氨基能与蛋白质的氨基能与H H+ +结合成结合成R RNHNH3 3+ +，使其，使其具有弱碱性具有弱碱性：RNH2CO O H HRCO O HNH3它在酸性溶液中带正电，在碱性溶液中带负电。它在酸性溶液中带正电，在碱性溶液中带负电。 15蛋白质的等电点：蛋白质的等电点：当溶液处于某一当溶液处于某一pH值时，蛋白质质点所带的净电值时，蛋白质质点所带的净电荷恰好为零，此

12、时的荷恰好为零，此时的pH值就称为值就称为蛋白质的等电点蛋白质的等电点等电点状态时，蛋白质之间的静电排斥力最小，此时等电点状态时，蛋白质之间的静电排斥力最小，此时蛋白质质点迅速结合成聚集体，沉淀极易析出。蛋白质质点迅速结合成聚集体，沉淀极易析出。在抗生素的生产过程中，一般将发酵液的在抗生素的生产过程中，一般将发酵液的pH值调至值调至23的偏酸性范围或的偏酸性范围或89的偏碱性范围内，使蛋白质变的偏碱性范围内，使蛋白质变性沉淀。性沉淀。链霉素生产中，采用调链霉素生产中，采用调pH至酸性（至酸性（pH3.0），加热），加热至至70，维持半个小时的方法来去除蛋白质，能使过，维持半个小时的方法来去除蛋

13、白质，能使过滤速度增大滤速度增大10-100倍，滤液粘度可降低倍，滤液粘度可降低1/6。161、在低离子强度和、在低离子强度和pH值约为等电点的条件下进行值约为等电点的条件下进行2、在偏酸性范围内，多通过加入无机酸（如盐酸、在偏酸性范围内，多通过加入无机酸（如盐酸、磷酸和硫酸等）调节磷酸和硫酸等）调节pH值完成等电点沉淀值完成等电点沉淀条件：条件：一般多用于疏水性较大的蛋白质。一般多用于疏水性较大的蛋白质。范围：范围：优点：优点：省去了后续的脱盐操作，并且当沉淀操作的省去了后续的脱盐操作，并且当沉淀操作的pH值较低时，杂蛋白更容易变性，是蛋白质初级分离的值较低时，杂蛋白更容易变性，是蛋白质初级

14、分离的有效手段。有效手段。 缺点：缺点：极端极端pH值会导致某些目的产物失活，并且值会导致某些目的产物失活，并且需消耗大量的酸碱。因此，采用调节需消耗大量的酸碱。因此，采用调节pH值实现等电值实现等电点沉淀有一定的局限性。点沉淀有一定的局限性。173. 加热法加热法原理：原理：热敏性是蛋白质的一个显著特性，有些蛋热敏性是蛋白质的一个显著特性，有些蛋白质在白质在50即失去活性而变性。一般的蛋白质在即失去活性而变性。一般的蛋白质在7080则不可逆的变性析出。则不可逆的变性析出。在柠檬酸的生产过程中，将发酵液加热到在柠檬酸的生产过程中，将发酵液加热到80可以可以使蛋白质变性凝固，降低发酵液的粘度，在

15、除去杂使蛋白质变性凝固，降低发酵液的粘度，在除去杂蛋白的同时，过滤速度也得到了提高。蛋白的同时，过滤速度也得到了提高。 该方法操作简单，成本低该方法操作简单，成本低缺点：缺点：导致目标产品的变性，目标产品为热敏性导致目标产品的变性，目标产品为热敏性 物质时，应该谨慎使用。物质时，应该谨慎使用。184. 溶剂沉淀法溶剂沉淀法原理：原理：有机溶剂使蛋白质分子表面荷电基团或亲水有机溶剂使蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，破坏蛋白质胶体的水膜，降基团的水化程度降低，破坏蛋白质胶体的水膜，降低溶液的介电常数。这使得蛋白质之间的静电引力低溶液的介电常数。这使得蛋白质之间的静电引力增大，产生凝

16、聚和沉淀。增大，产生凝聚和沉淀。 影响因素：影响因素：由于有机溶剂沉淀也是利用同种分子之间由于有机溶剂沉淀也是利用同种分子之间的相互作用，因此无机盐对蛋白质的溶解度影响很大，的相互作用，因此无机盐对蛋白质的溶解度影响很大，在低离子强度和等电点附近，容易生成沉淀，所需的在低离子强度和等电点附近，容易生成沉淀，所需的有机溶剂量较少。并且随着蛋白质相对分子质量的增有机溶剂量较少。并且随着蛋白质相对分子质量的增大，有机溶剂沉淀越容易进行，有机溶剂的加入量也大，有机溶剂沉淀越容易进行，有机溶剂的加入量也越少。越少。19易引起目标蛋白质变性，沉淀操作必须在低温下进行，易引起目标蛋白质变性，沉淀操作必须在低

17、温下进行，成本较高。一般只适用于液体处理量较少的情况。成本较高。一般只适用于液体处理量较少的情况。常用于沉淀的有机溶剂有丙酮和乙醇常用于沉淀的有机溶剂有丙酮和乙醇有机溶剂的密度较低，产生的沉淀物易于分离有机溶剂的密度较低，产生的沉淀物易于分离优点：优点：缺点：缺点：201、降低发酵液的粘度、降低发酵液的粘度加热法和加水稀释法两种加热法和加水稀释法两种目的：提高过滤速率目的：提高过滤速率例如，在例如，在40时，时，12Be麦芽汁麦芽汁的粘度为的粘度为1.210-3Pas，当温度升至，当温度升至75时，粘度可下降一半，过滤时，粘度可下降一半，过滤速率加倍。对于链霉素的发酵液，在速率加倍。对于链霉素

18、的发酵液，在pH值值3.0的条件的条件下，升温至下，升温至70后维持半小时，可使液体粘度下降后维持半小时，可使液体粘度下降1/6，过滤速率增大，过滤速率增大10100倍。倍。 发酵液处理性能的改善发酵液处理性能的改善212 2、 调节调节pHpH值值改善过滤特性改善过滤特性1、对于氨基酸和蛋白质等两性物质而言，将、对于氨基酸和蛋白质等两性物质而言，将pH值调值调至等电点，即可沉淀除去。至等电点，即可沉淀除去。2、在膜过滤时，发酵液中的大分子物质容易吸附于、在膜过滤时，发酵液中的大分子物质容易吸附于膜上，调节膜上，调节pH值可改变易吸附分子的电荷性质，减值可改变易吸附分子的电荷性质，减少膜的堵塞

19、和污染。少膜的堵塞和污染。3、在合适的、在合适的pH值下，细胞和细胞碎片及某些胶体物值下，细胞和细胞碎片及某些胶体物质会趋于絮凝状态，形成较大的颗粒，有利于过滤质会趋于絮凝状态，形成较大的颗粒，有利于过滤操作的进行。操作的进行。22絮凝技术絮凝技术1 、增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降、增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降速度；速度；2、降低发酵液粘度（结合其他的预处理方法，、降低发酵液粘度（结合其他的预处理方法，如稀释、加热等）；如稀释、加热等）；3、采用普通、简单、有效的过滤方法，实现固、采用普通、简单、有效的过滤方法，实现固液分离。液分离。目的：目的：23絮凝絮凝：指在某些高分子

20、絮凝剂存在下，基于架桥：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程以物理的集合为主的过程 絮凝的优点：能耗低、易操作、工作量小絮凝的优点：能耗低、易操作、工作量小1 1、絮凝和凝聚的区别、絮凝和凝聚的区别凝聚凝聚：指在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的：指在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象降低，而使胶体体系不稳定的现象 24（1）胶体理论）胶体理论 把细菌直接当作胶体溶液中的胶粒来解释絮凝把细菌直接当作胶体溶液中的胶粒来解释絮凝过程。絮凝是由于细胞表面的极性基团引

21、起的表面过程。絮凝是由于细胞表面的极性基团引起的表面吸附，而使表面自由能降低的过程。吸附，而使表面自由能降低的过程。（2）高聚物架桥理论）高聚物架桥理论W.C.Megreor发现细胞在表面分泌出许多高聚物如发现细胞在表面分泌出许多高聚物如蛋白质、多糖等，这些高聚物在细胞膜表面形成胞蛋白质、多糖等，这些高聚物在细胞膜表面形成胞外纤丝。细胞的絮凝是由于这些胞外纤丝之间架桥外纤丝。细胞的絮凝是由于这些胞外纤丝之间架桥交联形成的。这个理论可以解释絮凝取决于细胞生交联形成的。这个理论可以解释絮凝取决于细胞生长的胞龄以及表面分泌物的种类和数量。长的胞龄以及表面分泌物的种类和数量。2 2、 絮凝机理絮凝机理

22、25图图12 高分子絮凝剂的混合、吸附和絮凝作用示意图高分子絮凝剂的混合、吸附和絮凝作用示意图(a)聚合物分子在液相中分散、均匀分布在离子之间；聚合物分子在液相中分散、均匀分布在离子之间；(b)聚合物分子链在粒子表面的吸附；聚合物分子链在粒子表面的吸附；(c)被吸附链的重排，高分子链包围在胶粒表面，产生保护作被吸附链的重排，高分子链包围在胶粒表面，产生保护作用，是架桥作用的平衡构象；用，是架桥作用的平衡构象；(d)脱稳粒子互相碰撞，形成架桥絮凝作用；脱稳粒子互相碰撞，形成架桥絮凝作用；(e)絮团的打碎絮团的打碎26大多数细胞表面都有一定大多数细胞表面都有一定的电荷，絮凝过程是加入的电荷，絮凝过

23、程是加入电解质后，相同电荷的排电解质后，相同电荷的排斥以及细胞表面水合程度斥以及细胞表面水合程度不同而产生聚并的过程。不同而产生聚并的过程。Kakii通过实验证实细胞表通过实验证实细胞表面的离子键和氢键参与了面的离子键和氢键参与了细胞的絮凝过程。细胞的絮凝过程。(3) (3) 双电层理论双电层理论27常见的絮凝剂常见的絮凝剂絮凝剂从化学结构看，主要分为三类：高聚物、絮凝剂从化学结构看，主要分为三类：高聚物、无机盐、有机溶剂及表面活性剂。无机盐、有机溶剂及表面活性剂。有机溶剂：有机溶剂：成本高、用量大。如乙醇、丙酮和甲醛成本高、用量大。如乙醇、丙酮和甲醛无机絮凝剂：无机絮凝剂：效果好、但通用性不

24、好效果好、但通用性不好阳离子对带负电的胶粒凝聚能力的次序为：阳离子对带负电的胶粒凝聚能力的次序为：主要有主要有Al2(SO4)3、NaCl、Na3PO4、CaCl2和明胶等和明胶等 LiNaKMgCaHFeAl223328优点：优点：用量少（一般以用量少（一般以ppm计算），絮凝体粗大，分计算），絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多，使用范围广，目离效果好，絮凝速度快以及种类多，使用范围广，目前主要用于提纯杂质为蛋白质或菌丝体的发酵液。前主要用于提纯杂质为蛋白质或菌丝体的发酵液。高分子有机物高分子有机物共同特点：共同特点：具有长链状的结构，利用长链上的活性基团，具有长链状的结构，利用长

25、链上的活性基团，通过静电引力，形成桥架连接，从而生成菌团沉淀。通过静电引力，形成桥架连接，从而生成菌团沉淀。合成有机物：聚丙烯酰胺类絮凝剂合成有机物：聚丙烯酰胺类絮凝剂缺点：缺点：存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺29聚丙烯酸类阴离子絮凝剂，它们无毒，可用于聚丙烯酸类阴离子絮凝剂，它们无毒，可用于食品和医药工业中。食品和医药工业中。 壳聚糖、海藻酸钠、明胶、骨胶等壳聚糖、海藻酸钠、明胶、骨胶等优点：无毒无害，环境友好优点：无毒无害，环境友好天然的高分子絮凝剂天然的高分子絮凝剂聚合铝盐、聚合铁盐聚合铝盐、聚合铁盐由微生物产生的具有絮凝效果的代谢物由微

26、生物产生的具有絮凝效果的代谢物多无毒，安全性好，高效性（用量少）多无毒，安全性好，高效性（用量少）无机高分子聚合物：无机高分子聚合物：微生物：微生物： 多为多糖和核酸、蛋白质多为多糖和核酸、蛋白质絮凝剂种类絮凝剂种类絮凝剂絮凝剂絮凝细胞絮凝细胞高高聚聚物物核酸核酸DNADNA细菌细菌蛋白质蛋白质 -细菌细菌纤维素纤维素 -酵母酵母聚电解质聚电解质聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺细菌细菌聚乙烯亚胺聚乙烯亚胺细菌细菌多糖多糖葡聚糖葡聚糖细菌细菌壳聚糖壳聚糖酵母酵母有有机机物物溶剂溶剂乙醇乙醇酵母酵母丙酮丙酮酵母酵母其他有机物其他有机物腐殖酸腐殖酸酵母酵母鞣酸鞣酸 单宁单宁酵母酵母无无机机物物金属离子金属离子镁

27、盐镁盐细菌、酵母细菌、酵母钙盐钙盐细菌、酵母细菌、酵母铝盐铝盐 酵母、藻类酵母、藻类无机盐无机盐硼酸盐硼酸盐酵母酵母31絮凝的作用絮凝的作用1、滤速加快、滤液更清，改善滤液质量，去除、滤速加快、滤液更清，改善滤液质量，去除杂蛋白与固体杂质杂蛋白与固体杂质2、可在胞外循环、可在胞外循环利用基因工程手段，可以利用基因工程手段，可以得到自身絮凝和沉降性能得到自身絮凝和沉降性能很好的酵母。很好的酵母。 絮凝酵母与传统的固定化细胞相比，具有以下优点：絮凝酵母与传统的固定化细胞相比，具有以下优点：不需要固定化细胞载体、成本低、节省空间、可以获不需要固定化细胞载体、成本低、节省空间、可以获得高菌体浓度，实现

28、连续发酵。得高菌体浓度，实现连续发酵。323、酶分离纯化、酶分离纯化细胞破碎细胞破碎絮凝絮凝酶酶例：例： -半乳糖甘酶（胞内酶）的分离纯化半乳糖甘酶（胞内酶）的分离纯化细胞破碎细胞破碎离心分离离心分离澄清液澄清液 -半乳糖甘半乳糖甘酶发酵液酶发酵液壳聚糖壳聚糖+聚乙酰亚胺聚乙酰亚胺CaCl2调节调节pH细胞碎片细胞碎片+部分可溶部分可溶性杂蛋白性杂蛋白 -半乳糖甘酶的活性没有影响半乳糖甘酶的活性没有影响33影响因素影响因素1、絮凝剂浓度：浓度上升，有利于架桥；浓度过多，、絮凝剂浓度：浓度上升，有利于架桥；浓度过多，引起吸附饱和，形成胶粒，产生二次稳定。引起吸附饱和，形成胶粒，产生二次稳定。2、

29、分子量：分子量上升，有利于架桥，但水溶性降、分子量：分子量上升，有利于架桥，但水溶性降低。低。3、pH值：影响离子型絮凝剂中功能团的电离度，值：影响离子型絮凝剂中功能团的电离度，从而影响分子链的伸展，电离度上升，伸展状态上从而影响分子链的伸展，电离度上升，伸展状态上升。升。助滤剂的加入方法助滤剂的加入方法（1 1）预涂层：一种是在过滤介质表面预先涂一）预涂层：一种是在过滤介质表面预先涂一层助滤剂（涂层厚约层助滤剂（涂层厚约1 12mm2mm）（2 2）直接加入：另一种是将助滤剂直接加入发）直接加入：另一种是将助滤剂直接加入发酵液中，两种方法也可同时使用酵液中，两种方法也可同时使用细胞收集技术（

30、固液分离技术）细胞收集技术（固液分离技术）1、过滤2、离心3、膜分离36则离心沉降速度为： LLspsrNdu 184)(222 373.2离心方法3.2.1差速离心目的：以菌体细胞的收集或除去为目的，是分级离心操作的一种特殊情况，称为一级分级分离。 在差速离心操作中，离心转速和时间等操作条件要根据实际物系的特点（目标产物和其他组分的性质和相互作用）、分离的目的和所需的分离程度来选择，从而使料液中的不同组分得到分级分离。 根据离心方式的不同，分为差速离心和区带离心38主要菌体和细胞的离心分离菌体菌体、细胞细胞大小大小/m离心力离心力/g菌体菌体、细胞细胞大小大小/m离心力离心力/g实验实验室室

31、工业工业规模规模实验实验室室工业工业规模规模大肠大肠杆菌杆菌2-4150013000红血红血球球6-91200-酵母酵母2-715008000淋巴淋巴球球7-12500-血小血小板板2-45000-肝细肝细胞胞20-30800-39细胞破碎液的差速离心分级 细胞破碎液离心600g，10min沉降层细胞核(4-6m)上清液细胞膜碎片线粒体(1m)溶酶体(0.25-0.5m)核糖体(18nm)水溶性物质离心10000g，10min沉降层细胞碎片线粒体溶酶体上清液核糖体水溶性物质离心100000g，3h沉降层核糖体上清液水溶性物质40根据离心操作条件 差速区带离心 平衡区带离心沉降系数不同的组分在密

32、度梯度中会形成各自不同的区带。差速区带离心的密度梯度中最大密度小于待分离的目标产物的密度。在密度梯度中，料液中的各个组分就会由于沉降系数的差异而以不同的速度沉降，产生与组分对应的区带。差速区带离心的原理3.2.2 区带离心41离心之前要先用某种低分子量溶液（如蔗糖溶液）调配好密度梯度，操作可在离心管中完成。其次，将待处理的料液加在密度梯度之上，就可以进行离心操作了。两种区带离心法的共同之处1、平衡区带离心密度梯度比差速离心的密度梯度大2、料液中的高分子溶质在与其自身密度相等的溶剂密度处形成稳定的区带，区带中的溶质浓度以该密度为中心，呈高斯分布。平衡区带离心421、事先调配好的不同浓度的蔗糖溶液

33、，依浓度由大到小逐层加入离心管中即可形成密度梯度。2、如果要制成连续的蔗糖密度梯度，则将一定浓度的蔗糖溶液高速离心一段时间即可。3、除蔗糖外，如CsCl（可用于核酸的分离）和NaBr（可用于脂蛋白的分离）等，在离心力的作用下可以自动形成密度梯度。4、区带离心法一般适用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化。5、缺点是处理量小，仅限于实验室规模。方法：432.3 细胞破碎技术细胞破碎技术1 1、机械法破碎、机械法破碎2 2、化学法、化学法3 3、酶法、酶法4 4、选择性释放、选择性释放胞内蛋白质的提取方法1 1. .化学处理提取法化学处理提取法2 2. .双水相提取法双水相提取法3 3. .溶菌酶

34、提取法溶菌酶提取法4 4. .渗压冲击提取法渗压冲击提取法5 5. .电脉冲提取法电脉冲提取法6 6. .分步、分级提取法分步、分级提取法1.化学处理提取法 通过使用较弱的化学试剂如螯合剂、有机溶剂、表面通过使用较弱的化学试剂如螯合剂、有机溶剂、表面活性剂等作用于细胞，改变其表面特性，特别是细胞活性剂等作用于细胞，改变其表面特性，特别是细胞通透性，使目标产物得以有效提取通透性，使目标产物得以有效提取2. 双水相提取法 双水相体系被广泛用于蛋白质、核酸和病毒等生物产双水相体系被广泛用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离纯化品的分离纯化 处理量大、速度快、容易放大且不易变性处理量大、速度快、容易放

35、大且不易变性3. 溶菌酶提取法 如用如用-1,3-1,3-甘露糖苷酶可以提取出分布在细胞壁表面甘露糖苷酶可以提取出分布在细胞壁表面和内部的甘露糖蛋白，从而改变细胞的多孔性和渗透和内部的甘露糖蛋白，从而改变细胞的多孔性和渗透性，达到提取胞内蛋白的目的性，达到提取胞内蛋白的目的4 渗压冲击提取法 将细胞放在高渗介质中，达到平衡后介质被突然将细胞放在高渗介质中，达到平衡后介质被突然稀释或者将细胞转入低渗溶液中，由于渗透压的迅速稀释或者将细胞转入低渗溶液中，由于渗透压的迅速变化，水大量进入细胞内，引起细胞壁破损，从而使变化，水大量进入细胞内，引起细胞壁破损，从而使细胞通透性增大。细胞通透性增大。 该法选择性很高，且提取速度快、工艺简单、易该法选择性很高，且提取速度快、工艺简单、易放大。放大。5 电脉冲提取法 用电脉冲处理微生物细胞会造成细胞壁的电损伤，用电脉冲处理微生物细胞会造成细胞壁的电损伤，从而改变细胞的通透性。从而改变细胞的通透性。 该法条件温和、速度快。该法条件温和、速度快。6 分步、分级提取法 由于不同蛋白提