生物制药技术-第二章-基因工程制药(1,2,3,4小节)

1、第二章第二章 基因工程制药基因工程制药-第一节，第二节，第三节，第四节第一节，第二节，第三节，第四节第一节概第一节概 述述现代生物技术是一项与医药产业相互结合极为密切现代生物技术是一项与医药产业相互结合极为密切的高技术，它的发展不仅促进某些医学基础学科发的高技术，它的发展不仅促进某些医学基础学科发生革命性变化，也为医药工业发展开辟了更为广阔生革命性变化，也为医药工业发展开辟了更为广阔的新领域。生物技术的核心是基因工程，基因工程的新领域。生物技术的核心是基因工程，基因工程技术的成就之一是用于生物治疗的新型药物的研制。技术的成就之一是用于生物治疗的新型药物的研制。从从19821982年第一个基因重

2、组产品年第一个基因重组产品-人胰岛素在美国问世人胰岛素在美国问世以来，吸引和激励着科学家利用基因工程技术研制以来，吸引和激励着科学家利用基因工程技术研制新产品，迄今累计已有近新产品，迄今累计已有近3030种基因工程药物投入市种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效益和经济效益。生物技术场，产生了巨大的社会效益和经济效益。生物技术用于疾病的预防和疑难病症的治疗已经成为现实。用于疾病的预防和疑难病症的治疗已经成为现实。虽然一些内源生理活性物质作为药物己有多年，如治疗糖尿病虽然一些内源生理活性物质作为药物己有多年，如治疗糖尿病的胰岛素，治疗侏儒症的人生长激素等。但是许多在疾病诊断、的胰岛素，治疗侏

3、儒症的人生长激素等。但是许多在疾病诊断、预防和治疗中有重要价值的内源生理活性物质预防和治疗中有重要价值的内源生理活性物质( (如激素、细胞因如激素、细胞因子、子、 神经多肽、调节蛋白、酶类及凝血因子等人体活性多肽神经多肽、调节蛋白、酶类及凝血因子等人体活性多肽) )以以及某些疫苗，由于材料来源困难或技术方法问题而无法研制出及某些疫苗，由于材料来源困难或技术方法问题而无法研制出产品，付之应用。即使应用传统技术从动物脏器中提取出来，产品，付之应用。即使应用传统技术从动物脏器中提取出来，也因造价太高而使患者望而却步。即使用得起，亦因来源有限也因造价太高而使患者望而却步。即使用得起，亦因来源有限而供不

4、应求。而且由于免疫抗原的缘故，在使用上受到限制；而供不应求。而且由于免疫抗原的缘故，在使用上受到限制；在提取过程中难免有病毒感染，可能会对患者造成严重后果。在提取过程中难免有病毒感染，可能会对患者造成严重后果。基因工程技术的应用，从根本上解决了上述问题。自基因工程技术的应用，从根本上解决了上述问题。自2020世纪世纪7070年代某因工程诞生以来，最先应用基因工程技术且目前最为活年代某因工程诞生以来，最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学，基因工程技术的迅猛发展使人们跃的研究领域便是医药科学，基因工程技术的迅猛发展使人们己能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性己能

5、够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。基因工程新药在解决癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分基因工程新药在解决癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病等方面已取得明显的效果，为上述疾病的治疗、预防泌疾病等方面已取得明显的效果，为上述疾病的治疗、预防和诊断提供了新型药物、新型疫苗和新型诊断试剂。这些药和诊断提供了新型药物、新型疫苗和新型诊断试剂。这些药物都是用传统方法很难生产的珍贵稀有的药品，主要是医用物都是用传统方法很难生产的珍贵稀有的药品，主要是医用活性蛋白和多肤类，包括活性蛋白和多肤类，包

6、括免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体。免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体。细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子及凝血因子。子、表皮生长因子及凝血因子。 激素，如胰岛素、生长激素、心钠素。激素，如胰岛素、生长激素、心钠素。酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂及超氧化物歧化酶等。原激活剂及超氧化物歧化酶等。可用于医药目的的蛋白质或活性多肤都是由相应的基因合成可用于医药目的的蛋白质或活性多肤都是由相应的基因合成的。而基因工程技术的最大好处在于它有能力

7、从极端复杂的的。而基因工程技术的最大好处在于它有能力从极端复杂的机体细胞内取出所需要的基因，将其在体外进行剪切拼接、机体细胞内取出所需要的基因，将其在体外进行剪切拼接、重新组合，重新组合，第二节第二节 基因工程药物生产的过程基因工程药物生产的过程然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的蛋白质。所以利用基因工程技术生产药品数千倍的相应的蛋白质。所以利用基因工程技术生产药品的优点在于：的优点在于：利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽蛋白和多肽( (如胰

8、岛素、干扰素、细胞因子等如胰岛素、干扰素、细胞因子等) )，为临床使用，为临床使用建立有效的保障。建立有效的保障。可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这此物质的应用范围。化和结构进行深入的研究，从而扩大这此物质的应用范围。利用基因工程可以发现挖掘更多的内源性生理活性物质。利用基因工程可以发现挖掘更多的内源性生理活性物质。内源生理活性物质在作为药物使用时，存在不足之处，内源生理活性物质在作为药物使用时，存在不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程对其进行改造。如白细胞可以通过基因工程和蛋白质工程对其进行改造

9、。如白细胞介素介素-2 -2第第125125位半胱氨酸是游离的位半胱氨酸是游离的. .有可能引起二硫键的错配有可能引起二硫键的错配而导致活性下降，将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸后，而导致活性下降，将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸后，白细胞介素白细胞介素-2 -2的活性以及热稳定性均有提高。利用基因工的活性以及热稳定性均有提高。利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。2020世纪世纪7070年代初，利用重组年代初，利用重组DNADNA实验将实验将哺乳动物基因导人细菌体内，并表达成哺乳动物基因导人细菌体内，并表达成功，开创了生物技术制药工业。短短

10、功，开创了生物技术制药工业。短短2020余年时间就获得了诸如人胰岛索、人生余年时间就获得了诸如人胰岛索、人生长激素、长激素、- -干扰素、白细胞介素干扰素、白细胞介素-2 -2等多等多种生物技术药品，并已上市。种生物技术药品，并已上市。19971997年美年美国已批准上市的基因工程药物、疫苗和国已批准上市的基因工程药物、疫苗和注射用单克隆抗体达注射用单克隆抗体达3939种，种，20042004年已超年已超过过150150种。种。我国基因工程药物研究和开发起步较晚，基础较差。我国基因工程药物研究和开发起步较晚，基础较差。20 20 世纪世纪7070年代末以来，开始应用年代末以来，开始应用 DNA

11、 DNA重组技术、淋重组技术、淋巴细胞杂交瘤技术、细胞培养、克隆表达等技术开巴细胞杂交瘤技术、细胞培养、克隆表达等技术开发新产品和改造传统制药工艺。几十年来，在国家发新产品和改造传统制药工艺。几十年来，在国家汁划，特别是国家汁划，特别是国家863863高技术计划的优先支持下，高技术计划的优先支持下，使这一领域迅速发展，缩短了我国与世界先进国家使这一领域迅速发展，缩短了我国与世界先进国家的差距。的差距。863863高技术计划在生物技术领域内研究的高技术计划在生物技术领域内研究的三个主题之一是新型药物、疫苗与基因治疗，重点三个主题之一是新型药物、疫苗与基因治疗，重点是利用现代生物技术手段，开发化学

12、合成法难以生是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生产的医药产品，如肝炎、肿瘤、传染病和心脑血管产的医药产品，如肝炎、肿瘤、传染病和心脑血管疾病预防、诊断和治疗的生物技术医药产品。疾病预防、诊断和治疗的生物技术医药产品。我国科学家经过我国科学家经过8 8年刻苦攻关，成功地研制年刻苦攻关，成功地研制出世界上第一个采用中国健康人白细胞中出世界上第一个采用中国健康人白细胞中克隆的克隆的1b1b型干扰素基因，组建杂交质粒，型干扰素基因，组建杂交质粒，转染大肠杆菌使之高效表达的人转染大肠杆菌使之高效表达的人1b1b干扰素。干扰素。它源于中国人基因，最适于黄种人使用，它源于中国人基因，最适于黄种人使用

13、，该产品的该产品的2020多种指标达到国际先进水平。多种指标达到国际先进水平。a1ba1b型基因工程干扰素是由我国自行研制开型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技成果，发的具有国际先进水平的生物高科技成果，于于19971997年通过年通过期临床，并获得国家一类期临床，并获得国家一类新药证书，成为新药证书，成为863863计划生物技术领域第计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。一个实现产业化的基因工程药物。我困基因工程药物主要集中在仿制上。必须开我困基因工程药物主要集中在仿制上。必须开展创新基因工程药物的研究，如蛋白质工程展创新基因工程药物的研究，如蛋白质工

14、程 产产品、各种融合蛋白、各种细胞因子突变体和衍品、各种融合蛋白、各种细胞因子突变体和衍生物、小分子功能肽类等，可通过分子设计、生物、小分子功能肽类等，可通过分子设计、有控制的基因修饰及基因合成，创造世界上原有控制的基因修饰及基因合成，创造世界上原来没有的，但生物功能更优越的新型基因工程来没有的，但生物功能更优越的新型基因工程药物。同时，现代生物技术是一项十分复杂的药物。同时，现代生物技术是一项十分复杂的系统工程，其中的上游技术非常重要，是研究系统工程，其中的上游技术非常重要，是研究开发必不可少的。但从使实验室成果产业化、开发必不可少的。但从使实验室成果产业化、商品化的角度来看，上游技术就显得

15、更为重要。商品化的角度来看，上游技术就显得更为重要。而我国生物技术下游技术开发落后于上游技术，而我国生物技术下游技术开发落后于上游技术，如工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生如工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。我国生物技术的上电子计算机的优化控制等。我国生物技术的上游技术与国际先进水平相比仅相差游技术与国际先进水平相比仅

16、相差3535年，但下年，但下游技术则至少落后游技术则至少落后1515年以上。我们必须改变这年以上。我们必须改变这种状况，加强下游技术的研究和开发，使之与种状况，加强下游技术的研究和开发，使之与上游技术同步发展，尽量缩短与国际先进水平上游技术同步发展，尽量缩短与国际先进水平的差距。的差距。第二节第二节 墓因工程药物生产的过程墓因工程药物生产的过程基因工程技术就是将所要重组对基因工程技术就是将所要重组对象的日的基因插入载体、拼接、象的日的基因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞，构建成工程转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程重

17、新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。菌内进行复制和表达的技术。基因工程药物制造的主要步骤是基因工程药物制造的主要步骤是: :目的基因的克隆，构建目的基因的克隆，构建DNADNA重组重组体，构建工程菌，目的基因的表体，构建工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯达，外源基因表达产物的分离纯化，产品的检验等化，产品的检验等 ( (图图2 -1)2 -1)。本章。本章将重点介绍由基因工程菌生产的将重点介绍由基因工程菌生产的基因工程药物。基因工程药物。基因工程药物的生产是一项十分复杂的系统工程，基因工程药物的生产是一项十分复杂的系统工程，可分为上游和下游两个阶段。上游阶段是研究

18、开发可分为上游和下游两个阶段。上游阶段是研究开发必不可少的基础，主要是分离目的基因、构建工程必不可少的基础，主要是分离目的基因、构建工程菌菌( (细胞细胞) )。 下游阶段是从工程茵下游阶段是从工程茵( (细胞细胞) )的大规模培养的大规模培养直到产品的分离纯化、质量控制等。上游阶段的工直到产品的分离纯化、质量控制等。上游阶段的工作主要在实验室内完成。基因工程药物的生产必须作主要在实验室内完成。基因工程药物的生产必须首先获得目的基因，然后用限制酶和连接酶将所需首先获得目的基因，然后用限制酶和连接酶将所需目的基因插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入大目的基因插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入大肠杆

19、菌或其他宿主菌肠杆菌或其他宿主菌( (细胞细胞) )，以便大量复制目的基因。，以便大量复制目的基因。对目的基因要进行限制酶和核苷酸序列分析。目的对目的基因要进行限制酶和核苷酸序列分析。目的基因获得后，最重要的就是使目的基因正确表达。基因获得后，最重要的就是使目的基因正确表达。将目的基因与表达载体重组，转入合适的表达系统，将目的基因与表达载体重组，转入合适的表达系统，获得稳定高效表达的基因工程菌获得稳定高效表达的基因工程菌( (细胞细胞) )。下游阶段是将实验室成果产业化、商品化，它主要下游阶段是将实验室成果产业化、商品化，它主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物包括工程菌大规模发酵最

20、佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。工程菌的发酵工艺不同于传统的抗的优化控制等。工程菌的发酵工艺不同于传统的抗生素和氨基酸发酵，需要对影响目的基因表达的因生素和氨基酸发酵，需要对影响目的基因表达的因素进行分析，对各种影响因素进行优化，建立适于素进行分析，对各种影响因素进行优化，建立适于目的基因高效表达的发酵工艺，以便获得较高产量目的基

21、因高效表达的发酵工艺，以便获得较高产量的目的基因表达产物。为了获得合格的目的产物，的目的基因表达产物。为了获得合格的目的产物，必须建立起一系列相应的分离纯化、质量控制、产必须建立起一系列相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术。品保存等技术。第三节第三节 目的基因的获得目的基因的获得应用基因工程技术生产新型药物，首先必须构建应用基因工程技术生产新型药物，首先必须构建个特定的目的基因无性繁殖系，即产生各种新药的个特定的目的基因无性繁殖系，即产生各种新药的基因工程菌株。来源于真核细胞的产生基因工程药基因工程菌株。来源于真核细胞的产生基因工程药物的基因是不能进行直接分离的。真核细胞中单拷物的基因是不

22、能进行直接分离的。真核细胞中单拷贝基因只是染色体贝基因只是染色体DNADNA中的很小中的很小部分，为其部分，为其1010- -5 51010-7 -7，即使多拷贝基因也只有其即使多拷贝基因也只有其1010-3 -3，因此从染色体，因此从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难。另外，真核基中直接分离纯化目的基因极为困难。另外，真核基因内一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系因内一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系统，即使分离出真核基因，由于原核细胞缺乏统，即使分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNAmRNA的转录后加工系统，真核基因转录的的转录后加工系统，真核基因转录的mRNAmRNA也不能

23、加也不能加工、拼接成为成熟的工、拼接成为成熟的mRNAmRNA，因此不能直接克隆真核，因此不能直接克隆真核基因，必须采用特殊的方法分离目的基因。基因，必须采用特殊的方法分离目的基因。一、反转录法一、反转录法为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNADNA序列，可序列，可以从产生该蛋白质的真核细胞中提以从产生该蛋白质的真核细胞中提 取取mRNAmRNA，以其，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成该蛋白为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质质mRNAmRNA互补互补DNA(cDNA DNA(cDNA 第一链第一链) )，再以，再以cDNAcDNA第一第一链

24、为模板，在反转录酶或链为模板，在反转录酶或DNADNA聚合酶聚合酶I I （或者（或者KlenowKlenow酶大片段酶大片段) )作用下，最终合成编码该多肽的双链作用下，最终合成编码该多肽的双链DNADNA序列序列( (图图2 - 2)2 - 2)。由于。由于cDNAcDNA与模板与模板mRNAmRNA核核苷酸序列核核苷酸序列是严格互补的，因此是严格互补的，因此cDNAcDNA序列只反映基因表达的转序列只反映基因表达的转录及加工后产物所携带的信息，即录及加工后产物所携带的信息，即cDNAcDNA序列只与基序列只与基因的编码序列有关，而不含内含子。这是制取真核因的编码序列有关，而不含内含子。这

25、是制取真核生物日的基因常用的方法。生物日的基因常用的方法。1. 1. MRNAMRNA的纯化的纯化反转录法的前提是必须首先得到该目的基因的反转录法的前提是必须首先得到该目的基因的mRNAmRNA，而要，而要分离纯化目的基因的分离纯化目的基因的mRNAmRNA，其难度几乎不亚于分离目的基，其难度几乎不亚于分离目的基因。细胞内含有因。细胞内含有3 3种以上种以上RNARNA，mRNAmRNA占细胞内占细胞内RNARNA总量的总量的2%5%2%5%，相对分子质量大小很不一致，由几百到几千个核苷，相对分子质量大小很不一致，由几百到几千个核苷酸组成。在真核细胞中酸组成。在真核细胞中mRNAmRNA的的3

26、 3末端常含有一多聚腺苷酸末端常含有一多聚腺苷酸（polyA)polyA)组组 成的末端，长达成的末端，长达2025020250个腺苷酸，足以吸附于寡个腺苷酸，足以吸附于寡聚脱氧腺苷酸聚脱氧腺苷酸Oligo(dt)-Oligo(dt)-纤维素上，可以用亲和层析法将纤维素上，可以用亲和层析法将mRNAmRNA从细胞总从细胞总RNARNA中分离出来。利用中分离出来。利用mRNAmRNA的的3 3末端含有末端含有polyApolyA的特点，在的特点，在RNARNA流经寡聚（流经寡聚（dt dt）纤维素柱时，在高盐缓）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，冲液的作用下，mRNAmRNA被特异地结合在柱上，

27、当逐渐降低盐被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度洗脱时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，的浓度洗脱时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNAmRNA被被i i洗洗脱下来，经过两次寡聚脱下来，经过两次寡聚(dt)(dt)纤维素往后，可得到较高纯度的纤维素往后，可得到较高纯度的mRNAmRNA。2. CDNA2. CDNA第一链的合成第一链的合成一般一般mRNAmRNA都带有都带有3-polyA3-polyA，所以可用寡聚，所以可用寡聚(dt)(dt)作作为引物，在反转录酶的催化下，开始为引物，在反转录酶的催化下，开始cDNAcDNA链的链的合成。往往在合成反应体系中加入一种放射性合成。往往在合成反应

28、体系中加入一种放射性标记的标记的dNTP(dNTP(如如- -3232P-dATPP-dATP或或- -3232P-dCTP) P-dCTP) ，在反，在反应中和反应后可以通过测定放射性标记的应中和反应后可以通过测定放射性标记的dNTPdNTP掺入量，计算掺入量，计算cDNAcDNA的合成效率的合成效率; ;在凝胶电泳后，在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应条件。一次好的反转录反应可使寡聚佳反应条件。一次好的反转录反应可使寡聚（dt dt）选出的）选出的mRNAmRNA有有5%30%5%30%被合成被合成cDNAcDNA。3. C

29、DNA3. CDNA第二链的合成第二链的合成先用碱解或先用碱解或RNaseHRNaseH酶解的方法除去酶解的方法除去cDNA-cDNA-mRNAmRNA杂交链中的杂交链中的mRNAmRNA链，然后以链，然后以cDNA cDNA 第一第一链为模板合成第二链。由于第一条链为模板合成第二链。由于第一条cDNAcDNA链链3 3末末端往往形成半个发夹形结构，所以，可以端往往形成半个发夹形结构，所以，可以 从这从这一点开始合成一点开始合成cDNAcDNA第二链，此反应是在第二链，此反应是在DNADNA聚合酶聚合酶I I催化下完成的。核酸酶催化下完成的。核酸酶S1S1专一性切除单专一性切除单链链DNADN

30、A，用它可以切除发夹结构。切除发夹结，用它可以切除发夹结构。切除发夹结构后，常用变性琼脂糖凝胶电泳进行测定双链构后，常用变性琼脂糖凝胶电泳进行测定双链cDNAcDNA分子的大小。分子的大小。4. CDNA4. CDNA克隆克隆用于用于cDNAcDNA克隆的载体有两类克隆的载体有两类: :质粒质粒DNA(DNA(如如pUCpUC、pBR322pBR322等等) )和随菌体和随菌体DNA(DNA(如如gtl0gtl0、 gtll gtll等）。根据重等）。根据重组后插入的组后插入的cDNAcDNA是否能够表达，经转录和翻译合成是否能够表达，经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型载体和非表达型载

31、体，蛋白质，又将载体分为表达型载体和非表达型载体，pUCpUC及及AgtllAgtll为表达型载体，在为表达型载体，在cDNA cDNA 插入位置的上游插入位置的上游具有启动基因顺序，而具有启动基因顺序，而pBR322pBR322及及gtl0gtl0为非表达型载为非表达型载体。体。cDNAcDNA克隆操作中应根据不同的需要选择适当的克隆操作中应根据不同的需要选择适当的载体载体cDNAcDNA插入片段小于插入片段小于10 kb,10 kb,可选用质粒载体可选用质粒载体; ;如大如大于于10 kb10 kb则应选用噬菌体则应选用噬菌体DNADNA为载体。选用表达型载为载体。选用表达型载体可以增加目

32、的基因的筛选方法，有利于目的基因体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。的筛选。Richard YoungRichard Young和和Ronald DavisRonald Davis设计的设计的gtl0gtl0和和 gtl1 gtl1是噬菌体克隆载体，用于构建是噬菌体克隆载体，用于构建cDNAcDNA文库，它们文库，它们一方面有较高的克隆效率，只需少量一方面有较高的克隆效率，只需少量DNADNA便十便十分有效地产生许多克隆，每纳克分有效地产生许多克隆，每纳克cDNAcDNA可产生可产生50005000个克隆，另方面可容纳较大相对分子质量个克隆，另方面可容纳较大相对分子质量的外源的

33、外源DNADNA片段。由于噬菌斑的筛选和操作较片段。由于噬菌斑的筛选和操作较筛选细菌菌落在技术上更方便，因此这些载体筛选细菌菌落在技术上更方便，因此这些载体在构建文库时优于质粒载体在构建文库时优于质粒载体pBR322pBR322。在合适的。在合适的宿主中，宿主中，gtl0gtl0载体对于未携带载体对于未携带cDNAcDNA的噬菌体的的噬菌体的裂解生长有很强的生物学选择作用。裂解生长有很强的生物学选择作用。cDNA cDNA 插插入到入到gtl0gtl0可使噬菌体阻遏物基因可使噬菌体阻遏物基因(c 1)(c 1)失活。失活。当用大肠杆菌当用大肠杆菌c600c600的突变型的突变型hflA(hfl

34、A(高频溶源性高频溶源性) )作为宿主时，只作为宿主时，只有携带有携带cDNA cDNA 插入片段的噬菌体可形成噬菌斑插入片段的噬菌体可形成噬菌斑; ;而在非突变型而在非突变型大肠杆茵大肠杆茵c600c600宿主菌中，带与不带宿主菌中，带与不带cDNA cDNA 插入片段的噬菌体都插入片段的噬菌体都可形成噬菌斑。可形成噬菌斑。AgtllAgtll没有这种选择作用，但它是蛋白质表达没有这种选择作用，但它是蛋白质表达的的cDNAcDNA克隆载体。克隆载体。gtllgtll的宿主菌是大肠杆菌的宿主菌是大肠杆菌Y1090Y1090。gtllgtll中的中的 cDNAcDNA插入片段是克隆在插入片段是克

35、隆在-半乳糖苷酶基因编码区（半乳糖苷酶基因编码区（lacZ)lacZ)的羧的羧基端，在含基端，在含IPTGIPTG（异丙基硫代（异丙基硫代- - -D-D-半乳糖苷）和半乳糖苷）和X-galX-gal（5 - 5 - 溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚- - - D- D-半乳糖苷半乳糖苷) )的平板上，带的平板上，带cDNAcDNA插入片段的插入片段的gtllgtll可形成清晰的无色晦菌斑。未带可形成清晰的无色晦菌斑。未带cDNAcDNA插入片段的插入片段的gtllgtll可可形成蓝色噬菌斑。形成蓝色噬菌斑。cDNA cDNA 插入片段的翻译产物可表达成插入片段的翻译产物可表达成 - -半

36、乳半乳糖苷酶糖苷酶-cDNA-cDNA融合蛋白。融合蛋白。cDNAcDNA片段与载体的连接通常采用下面方法。一种方法是加同片段与载体的连接通常采用下面方法。一种方法是加同聚尾连接，用聚尾连接，用3 3末端脱氧核苷酸转移酶催化，使载体与末端脱氧核苷酸转移酶催化，使载体与cDNAcDNA的的3 3末端带上互补的同型多聚体序列，借助同型多聚体的退火末端带上互补的同型多聚体序列，借助同型多聚体的退火作用形成重组分子，最后用作用形成重组分子，最后用T4DNAT4DNA连接酶封口。若载体加上连接酶封口。若载体加上 polyCpolyC（或（或A A）的尾巴，则）的尾巴，则cDNAcDNA加上加上polyG

37、polyG（或（或T T）的尾巴，这）的尾巴，这两种黏性末端只能使载体与两种黏性末端只能使载体与cDNAcDNA连接而不能自我环化。另一连接而不能自我环化。另一种方法是加人工接头连接，用种方法是加人工接头连接，用T T DNA DNA连接酶在平末端接上连接酶在平末端接上人工接头可以使人工接头可以使DNADNA发生连接。所谓人工接头是指由人工合发生连接。所谓人工接头是指由人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点的寡核苷酸片段。酸片段。cDNcDN连上人工接头后，用该种限制酶酶切就可得到连上人工接头后，用该种限制酶酶切就可得到黏性末端，

38、从而能够与载体连接。黏性末端，从而能够与载体连接。cDNAcDNA中可能也带有同样的中可能也带有同样的限制酶切点，为了保护限制酶切点，为了保护cDNAcDNA不受限制酶破坏，保证不受限制酶破坏，保证DNADNA的完整，可以在加接头前先用甲基化酶修饰这且同样的限制的完整，可以在加接头前先用甲基化酶修饰这且同样的限制酶切点。酶切点。. .将重组体导人宿主细胞将重组体导人宿主细胞体外包装重组的体外包装重组的 噬菌体后，感染噬菌体后，感染感受态大肠杆菌形成噬菌斑感受态大肠杆菌形成噬菌斑; ;或转或转化感受态大肠杆菌使质粒进入细化感受态大肠杆菌使质粒进入细菌内。菌内。6. CDNA6. CDNA文库的鉴

39、定文库的鉴定根据重组体的表型进行筛选，主根据重组体的表型进行筛选，主要有抗性基因失活法和菌落或噬要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑颜色改变法。然后再采用凝菌斑颜色改变法。然后再采用凝胶电泳、分子杂交、胶电泳、分子杂交、DNADNA序列分序列分析测定等方法进行进一步筛选鉴析测定等方法进行进一步筛选鉴定。定。7. 7.目的目的CDNACDNA克隆的分离和鉴定克隆的分离和鉴定从从cDNAcDNA文库分离特异文库分离特异cDNAcDNA克隆主要采用下列两种克隆主要采用下列两种方法。方法。采用核酸探针杂交法。采用核酸探针杂交法。用层析和高分辨率电泳等技术纯化微克量的目的蛋用层析和高分辨率电泳等技术纯化微克

40、量的目的蛋白质，根据目的蛋白纯品的氨基酸序列白质，根据目的蛋白纯品的氨基酸序列 分析结果，分析结果，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNAcDNA文文库分离特异库分离特异cDNAcDNA克隆。克隆。 采用免疫反应鉴定法。在采用免疫反应鉴定法。在既无可供选择的基因表型特征，又没有合适探针的既无可供选择的基因表型特征，又没有合适探针的情况下，本法是筛选特异情况下，本法是筛选特异cDNAcDNA克隆的重要途径。用克隆的重要途径。用表达型载体构建的表达型载体构建的cDNAcDNA文库，可利用免疫学方法分文库，可利用免疫学方法分组逐一鉴定各组逐一鉴定各cDN

41、AcDNA的表达产物，即以某种蛋白质的的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异抗体寻找相应的特异cDNAcDNA克隆。克隆。分离得到含有目的基因的阳性克分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作进一步的验证隆后，必须对其作进一步的验证和鉴定。主要是限制酶图谱的绘和鉴定。主要是限制酶图谱的绘制，杂交分析，基因定位，基因制，杂交分析，基因定位，基因测序，确定基因的转录方向、转测序，确定基因的转录方向、转录起始点等。录起始点等。二、反转录二、反转录- -聚合酶链反应法聚合酶链反应法19851985年聚合酶链反应年聚合酶链反应(polymerase chain (polymerase chai

42、n reactionreaction， pCR) pCR)创立后，人们将它与反转录创立后，人们将它与反转录方法结合起来，得到一种新的合成方法结合起来，得到一种新的合成cDNAcDNA的的方法，即反转录方法，即反转录- -聚合酶链反应法。该方法聚合酶链反应法。该方法是是mRNAmRNA经反转录合成经反转录合成cDNAcDNA第一链，不需第一链，不需再合成再合成cDNAcDNA第二链，而是在特异引物协助第二链，而是在特异引物协助下，用下，用pCRpCR法进行扩增，特异地合成目的法进行扩增，特异地合成目的cDNAcDNA链，用于重组、克隆。链，用于重组、克隆。三、化学合成法三、化学合成法较小分子蛋白

43、质或多肽的编码基因可以人工化较小分子蛋白质或多肽的编码基因可以人工化学合成。化学合成法有个先决条件就是必须已学合成。化学合成法有个先决条件就是必须已知其核苷酸排列顺序，或者已知其蛋白质的氨知其核苷酸排列顺序，或者已知其蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNADNA的核的核苷酸序列。用化学方法合成此基因苷酸序列。用化学方法合成此基因DNADNA不同部不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成动性末端的端形成动性末端的DNADNA双链片段。然后将这些双链片段。然后将这些DNADNA片段按正确的次序进行退火连接

44、起来形片段按正确的次序进行退火连接起来形 成成较长的较长的DNADNA片段，再用连接酶连接成完整的基片段，再用连接酶连接成完整的基因。因。人工合成基因的限制主要有人工合成基因的限制主要有: :一是不能合一是不能合成太长的基因。目前成太长的基因。目前DNADNA合成仪所合成合成仪所合成的寡核苷酸片段最长不超过的寡核苷酸片段最长不超过60bp60bp，因此，因此，此方法只适用于克隆小分子肽的基因。此方法只适用于克隆小分子肽的基因。二是人工合成基因时，遗传密码的简并二是人工合成基因时，遗传密码的简并性会为选择密码子带来很大困难，当以性会为选择密码子带来很大困难，当以氨基酸顺序推测核苷酸序列时，不一氨

45、基酸顺序推测核苷酸序列时，不一 定定与天然基因完全一致，易造成中性突变。与天然基因完全一致，易造成中性突变。三是费用较高。三是费用较高。四、筛选基因的新方法四、筛选基因的新方法1. 1.编码序列富集法编码序列富集法该法是利用磁场力对该法是利用磁场力对cDNAcDNA文库中的目的基因进文库中的目的基因进行富集的一种技术。将质粒行富集的一种技术。将质粒DNADNA库用识别位点库用识别位点较多的酶酶切后连上接头，用较多的酶酶切后连上接头，用5 5端以生物素标记端以生物素标记的与接头序列相同的引物进行的与接头序列相同的引物进行pCRpCR扩增后，将扩增后，将cDNAcDNA文库的插入片段同样扩增后，两

46、者杂交得文库的插入片段同样扩增后，两者杂交得到带有生物素的到带有生物素的DNADNA双链，当溶液中加入含有双链，当溶液中加入含有磁珠核心的链霉抗生素蛋白时，磁珠核心的链霉抗生素蛋白时，DNADNA双链结合双链结合到磁珠上，在外加磁场的作用下，目的基因与到磁珠上，在外加磁场的作用下，目的基因与其他的其他的DNADNA片段分离，达到富集目的。片段分离，达到富集目的。2 2岛屿获救岛屿获救PCRPCR法法此法是直接从已拥测序的基因组此法是直接从已拥测序的基因组DNADNA上寻找编码序列，通过上寻找编码序列，通过计算机分析找出开放阅读框，采计算机分析找出开放阅读框，采 用外显子陷阱法和寻找用外显子陷阱

47、法和寻找CpGCpG岛的方法克隆编码基因。岛的方法克隆编码基因。CpGCpG岛是一段富含岛是一段富含CpGCpG序列的序列的DNADNA片段，它存在于几乎所有的持家基因和近一半的组织特异性片段，它存在于几乎所有的持家基因和近一半的组织特异性基因上，并且是很多基因的基因上，并且是很多基因的5 5端标记，端标记， 其他的组织特异性基其他的组织特异性基因上也存在因上也存在C+GC+G含量相对较高的片段。在含量相对较高的片段。在CpGCpG岛或岛或C C十十G G富集富集区中常有一些罕见的酶如区中常有一些罕见的酶如EgEg，SacSac、BssHBssH的切割位点，的切割位点，同时在基因组同时在基因组

48、DNADNA中均匀地分布着中均匀地分布着AluAlu重复序列，大约每重复序列，大约每3 kb3 kb就出现一次。该法就是利用了这两段序列，给就出现一次。该法就是利用了这两段序列，给CpGCpG岛所特有岛所特有的限制酶切割后的片段加上泡状接头，再用泡状引物和的限制酶切割后的片段加上泡状接头，再用泡状引物和AluAlu特特异性的引物进行异性的引物进行pCRpCR扩增，电泳分离出的特异性片段便可作为扩增，电泳分离出的特异性片段便可作为探针对探针对cDNAcDNA文库进行筛选。由于泡状引物与泡状接头非互补文库进行筛选。由于泡状引物与泡状接头非互补区的一条链序列相同，不能与互补链配对，所以只能从区的一条

49、链序列相同，不能与互补链配对，所以只能从AluAlu引引物处起始扩增，这样得到的扩增产物中均含有物处起始扩增，这样得到的扩增产物中均含有AluAlu序列。用这序列。用这种方法可以有效地对基因种方法可以有效地对基因5 5端进行扩增，但不含有端进行扩增，但不含有cpGcpG岛或岛或cpGcpG岛与岛与AluAlu序列相距较远时该方法不可行。序列相距较远时该方法不可行。3. 3.动物杂交法动物杂交法许多基因由于进化过程中存在保守性而在许多基因由于进化过程中存在保守性而在人和其他物种中具有高度同源性，因此利人和其他物种中具有高度同源性，因此利用已知序列的其他物种的基因从构建的人用已知序列的其他物种的基

50、因从构建的人基因组文库或基因组文库或cDNAcDNA文库中可以将目的基因文库中可以将目的基因调出。这种方法可以十分方便可靠地从基调出。这种方法可以十分方便可靠地从基因文库中调出有用基因。如果有同源性高因文库中调出有用基因。如果有同源性高的基因，可以作为探针使用。的基因，可以作为探针使用。 同样利用基同样利用基因家族成员间的序列相似性，也可以用基因家族成员间的序列相似性，也可以用基因家族中已知序列的成员调出其他成员。因家族中已知序列的成员调出其他成员。4. 4.功能克隆法功能克隆法依赖于基因表达产物和生物学功能的基依赖于基因表达产物和生物学功能的基因克隆法称为功能克隆法。该法不适于因克隆法称为功

51、能克隆法。该法不适于在不知道基因相关功能信息的条件下有在不知道基因相关功能信息的条件下有效地克隆新的基因。可采用基因敲除技效地克隆新的基因。可采用基因敲除技术、术、RNARNA干扰技术、酵母双杂交技术、干扰技术、酵母双杂交技术、高通量表达技术及流式细胞术等手段，高通量表达技术及流式细胞术等手段，从基因水平、表达调控水平、蛋白质水从基因水平、表达调控水平、蛋白质水平、细胞水平获得基因功能信息。平、细胞水平获得基因功能信息。5. 5.构建构建CDNACDNA文库文库通过表达序列标签通过表达序列标签(expressed (expressed sequence tagsequence tag， EST

52、) EST)进行基因作图和进行基因作图和基因组序列中编码序列的鉴别，基因组序列中编码序列的鉴别，ESTEST能提供设计引物的足够信息，能提供设计引物的足够信息，可以用可以用pCRpCR技术扩增基因组中特异技术扩增基因组中特异片段，是一种十分有用的片段，是一种十分有用的DNA DNA 位标。位标。6. 6.差异显示技术的应用差异显示技术的应用利用利用mRNAmRNA差异显示技术、减数差异显示技术、减数PCRPCR技术、差减杂交技术寻找新基技术、差减杂交技术寻找新基因。如通过正常组织和肿瘤组织某因。如通过正常组织和肿瘤组织某些基因和蛋白质的差异表达，寻找些基因和蛋白质的差异表达，寻找在肿瘤细胞中的

53、高表达基因或沉默在肿瘤细胞中的高表达基因或沉默基因，从而推测其可能是癌基因或基因，从而推测其可能是癌基因或抑癌基因。抑癌基因。五、对已发现基因的改造五、对已发现基因的改造通过对基因的功能相关区域研究，并采用基因修饰通过对基因的功能相关区域研究，并采用基因修饰技术和点突变技术进行基因新功能研究和再确证，技术和点突变技术进行基因新功能研究和再确证，从而提高目的基因表达产物的稳定性和体内半衰期，从而提高目的基因表达产物的稳定性和体内半衰期，提高表达产物的生物学活性，降低有效使用剂量或提高表达产物的生物学活性，降低有效使用剂量或提高表达量，降低毒性或免疫原性。蛋白质工程药提高表达量，降低毒性或免疫原性

54、。蛋白质工程药物的分子设计主要有以下方法用突变技术更换活性物的分子设计主要有以下方法用突变技术更换活性蛋白的某些关键氨基酸残基蛋白的某些关键氨基酸残基; ;通过增加、删除或调整通过增加、删除或调整分子上的某些肽段或结构城或寡糖链，使之改变活分子上的某些肽段或结构城或寡糖链，使之改变活性，生成合适糖型，产生新的生物功能性，生成合适糖型，产生新的生物功能; ;将功能互补将功能互补的两种基因的两种基因 工程药物在基因水平上融合，这种工程药物在基因水平上融合，这种 择优择优而取而取 的嵌合型药物，其功能不仅仅是原有药物功能的嵌合型药物，其功能不仅仅是原有药物功能的加和，还会出现新的药理作用，对表达产物

55、的后的加和，还会出现新的药理作用，对表达产物的后修饰可改善蛋白质工程药物药理作用。修饰可改善蛋白质工程药物药理作用。第四节第四节 基因表达基因表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因工程中基因高效表达是指外及所有加工过程。基因工程中基因高效表达是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。进行基因表达研究，人们

56、关心的问题主要是目的基进行基因表达研究，人们关心的问题主要是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此在进行基因表达活性和表达产物的分离纯化。因此在进行基因表达设计时，必须综合考虑各种影响因素，建立最佳的设计时，必须综合考虑各种影响因素，建立最佳的基因表达体系。基因表达体系。一、宿主菌的选择一、宿主菌的选择目的基因获得后，必须在合适的宿主菌中进行目的基因获得后，必须在合适的宿主菌中进行表达，才能获得目的产物。宿主菌应满足以下表达，才能获得目的产物。宿主菌应满足以下要求要求: :具有高浓度、高产量、高产率具有高浓度

57、、高产量、高产率; ;能利用易得能利用易得廉价原料廉价原料; ;不致病、不产生内毒素不致病、不产生内毒素; ;发热量低，需发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；容易进行氧低，适当的发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控，容易进行重组代谢调控，容易进行重组DNADNA技术技术; ;产物容易提产物容易提取纯化。基因表达的微生物宿主细胞分为两大取纯化。基因表达的微生物宿主细胞分为两大类。第一类为原核细胞，目前常用的有大肠杆类。第一类为原核细胞，目前常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；第二类为真核菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；第二类为真核细胞，常用的真核微生物有酵母、丝状真茵等。细胞，常用的真

58、核微生物有酵母、丝状真茵等。1. 1.原核细胞原核细胞(1)(1)大肠杆菌大肠杆菌由于对大肠杆菌分子遗传学的研究较深入，由于对大肠杆菌分子遗传学的研究较深入，目前大肠杆茵仍是基因工程研究中采用最目前大肠杆茵仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。大肠杆菌由于本身的多的原核表达体系。大肠杆菌由于本身的特点，其表达基因工程产物的形式多种多特点，其表达基因工程产物的形式多种多样，如细胞内不溶性表达（包含体样，如细胞内不溶性表达（包含体) )、胞内、胞内可溶性表达、细胞周质表达，极少数情况可溶性表达、细胞周质表达，极少数情况下也可分泌到细胞外。不问的表达形式具下也可分泌到细胞外。不问的表达形式具有不

59、同的表达水平及完全不同的杂质。有不同的表达水平及完全不同的杂质。大肠杆菌表达时不存在信号肽，故产品多为胞内产大肠杆菌表达时不存在信号肽，故产品多为胞内产物，提取时需将细胞破碎，导致细胞质内其他蛋白物，提取时需将细胞破碎，导致细胞质内其他蛋白质也释放出来，造成提取困难。由于分泌能力不足，质也释放出来，造成提取困难。由于分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物必须真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物必须在下游处理过程中，经在变性和复性处理才能恢复在下游处理过程中，经在变性和复性处理才能恢复其生物活性。在大肠杆菌中表达时，由于不存在翻其生物活性。在大肠杆菌中表达时，由于不存在翻译后

60、修饰作用，故对蛋白质产物不能糖基化，因此译后修饰作用，故对蛋白质产物不能糖基化，因此大肠杆菌只适于表达糖基化等翻译后修饰对其生物大肠杆菌只适于表达糖基化等翻译后修饰对其生物功能并非必须的真核蛋白质，在使用上受到一定限功能并非必须的真核蛋白质，在使用上受到一定限制。由于翻译常从编码甲硫氨酸的制。由于翻译常从编码甲硫氨酸的AUGAUG密码子开始，密码子开始，目的蛋白质的目的蛋白质的N N端常多一个甲硫氨酸残基，会引起免端常多一个甲硫氨酸残基，会引起免疫反应。大肠杆菌会产生内毒素，很难除去，还会疫反应。大肠杆菌会产生内毒素，很难除去，还会产生蛋白酶破坏目的蛋白质。产生蛋白酶破坏目的蛋白质。(2)(2