实验2分离以尿素为氮源的微生物

1、实验实验2 2：分离以尿素为氮源的微生物：分离以尿素为氮源的微生物1. 1. 使用使用专一专一的培养基（含尿素）分离专一的培养基（含尿素）分离专一的细菌（有脲酶的细菌）。的细菌（有脲酶的细菌）。2.2.使用使用指示剂颜色指示剂颜色的变化检知酶（脲酶）的变化检知酶（脲酶）所催化的反应。所催化的反应。 脲即尿素，是蛋白质降解的产物。有脲即尿素，是蛋白质降解的产物。有一些细菌含有一些细菌含有脲酶脲酶可以分解尿素，利用尿可以分解尿素，利用尿素作为其生长的素作为其生长的氮源氮源。(NH2) 2C=O+H2O 2NH3+CO2脲酶脲酶 本实验内容是从土壤中分离出能利用尿素的细菌，了解它在生态平衡中的作用，

2、并与LB全营养培养基做对照。 细菌细菌 尿素尿素 NHNH3 3 中性中性 碱性碱性 酚红颜色：酚红颜色： 黄色黄色 红色红色细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中的细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中的尿素分解，产生的氨使培养基变碱性，于是尿素分解，产生的氨使培养基变碱性，于是酚红由酚红由黄黄变变红红。随着培养时间的延长，红色。随着培养时间的延长，红色区域的面积越来越大。区域的面积越来越大。设备及用品：设备及用品： 灭菌锅或高压锅、灭菌锅或高压锅、250ml250ml的三角瓶的三角瓶1 1个和个和100 ml100 ml的三角的三角瓶瓶2 2个、封口膜和橡皮圈、培养皿个、封口膜和橡皮圈、培养皿

3、4 4个、接种环和玻璃三个、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性角刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球的广口瓶、镊子、有盖的试管塑料手套、装有酒精棉球的广口瓶、镊子、有盖的试管（15mm15mm150mm150mm）3 3支和试管架支和试管架实验材料：实验材料：(1)25mlLB(1)25mlLB固体培养基：蛋白胨固体培养基：蛋白胨0.25g0.25g、酵母提取物、酵母提取物0.12g0.12g、NaCl 0.25gNaCl 0.25g、琼脂糖、琼脂糖0.5g0.5g、加水、加水25ml25ml。(2) 25ml(2) 25ml尿素固体

4、培养基：尿素固体培养基：0.025g0.025g葡萄糖、葡萄糖、NaCl 0.12gNaCl 0.12g、K K2 2HPOHPO4 40.12g0.12g、酚红、酚红0.25mg0.25mg、琼脂糖、琼脂糖0.5g0.5g、加水、加水15ml15ml。灭菌冷却到。灭菌冷却到6060时加入经时加入经G6G6玻璃漏斗玻璃漏斗过滤（使其无菌过滤（使其无菌）的）的尿素尿素。 滤除滤除1.50.6um的病菌的病菌选择培选择培养基养基(1) (1) 灭菌灭菌：将配制好的：将配制好的25mlLB25mlLB固体培养基装入固体培养基装入100ml100ml的的三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。三角瓶中

5、，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。(2) (2) 制平板制平板：在：在6060左右时左右时, ,在酒精灯火焰旁将固体培在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在养基分别倒在2 2个培养皿中，在水平的超净工作台上摇个培养皿中，在水平的超净工作台上摇匀，平放至凝固。匀，平放至凝固。(3)(3)制备细菌悬液制备细菌悬液：在无菌条件下：在无菌条件下, ,将将1g1g土壤加到有土壤加到有99mL99mL无菌水的三角瓶中无菌水的三角瓶中, ,振荡振荡10min,10min,即成为即成为1010-2-2土壤稀释液土壤稀释液。依次制备。依次制备1010-3-3、1010-4-4和和1010-5-5土壤稀释液。取样时，尽

6、量土壤稀释液。取样时，尽量只取悬液。摇匀，放在试管架上。只取悬液。摇匀，放在试管架上。 (4) (4) 平板涂布分离平板涂布分离：取：取1010-4-4和和1010-5-5土壤稀释液各土壤稀释液各0.1mL0.1mL，分别加到分别加到LBLB培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存在在70%70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭，在酒精灯火焰旁边打开培养皿，将菌液涂布火焰熄灭，在酒精灯火焰旁边打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。到整个平面上。 涂布前后三角刮刀需要灼烧吗？涂布前后三角刮刀需要灼烧吗？

7、(5)培养皿倒置培养培养皿倒置培养：在37恒温箱中培养24-48h, 观察菌落数。 恒温恒温37培养结果培养结果LB培养基上培养基上10-2、10-3、10-4 、10-5稀释度土样涂布结果稀释度土样涂布结果尿素培养基上尿素培养基上10-2、10-3、10-4 、10-5稀释度土样涂布结果稀释度土样涂布结果分析与讨论：分析与讨论：1 1、为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？、为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？ 琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物氮化合物，如果用琼脂固化培养基，会为细菌，如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类

8、氮源，这样会在尿素固提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不体培养上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选利于以尿素为氮源的细菌的筛选如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下会被水解，水解后的氨使土壤变成碱性，与其会被水解，水解后的氨使土壤变成碱性，与其他阴离子形成化合物则会使土壤板结。他阴离子形成化合物则会使土壤板结。有脲酶有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用所形成的氨，有利于自然界的氮循环所形成的氨，有利于自然界的氮循环2 2、有脲酶的细菌

9、在生态稳态上起什么作用？、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用？3 3、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？带出现？细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素水解，尿细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素水解，尿素分解后产生氨，氨为碱性，酚红在酸性环境中为素分解后产生氨，氨为碱性，酚红在酸性环境中为黄色，在碱性环境里变为红色黄色，在碱性环境里变为红色。培养基中的酸碱指。培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化，标志着存在脲酶水解尿素的作示剂产生颜色变化，标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株可以以尿素为氮源。用，从而证明这一菌株可以以尿素为氮源。红色环红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强4 4、与全营养培养基上的菌落数比较，为什、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落？么尿素培养基上只有少数菌落