第三章生物制品制备

1、第三章生物制品制备一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法 （1 1）原料选择）原料选择原料的选择原则原料的选择原则： 有效成分含量高，新鲜；有效成分含量高，新鲜； 原料来源丰富，产地较近；原料来源丰富，产地较近； 原料中杂质含量少；原料中杂质含量少； 原料成本低等。原料成本低等。 植物原料生长的季节性；植物原料生长的季节性； 微生物原料的对数期；微生物原料的对数期； 动物原料的年龄与性别。动物原料的年龄与性别。动物原料：采集后要立即处理，去除结缔动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。植物

2、原料：要择时采集并就地去除不用的部植物原料：要择时采集并就地去除不用的部分，保鲜处理；分，保鲜处理；微生物原料：要及时将菌细胞与培养液分开微生物原料：要及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。，进行保鲜处理。 冷冻法冷冻法。该方法适用于所有生物原料。常用。该方法适用于所有生物原料。常用- -4040速冻。速冻。有机溶剂脱水法有机溶剂脱水法。常用的有机溶剂是丙酮。该。常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。没有破坏作用的原料，如脑垂体等。防腐剂保鲜防腐剂保鲜。常用乙醇、苯酚等。该法适用于。常用乙醇

3、、苯酚等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。液体原料，如发酵液、提取液等。 生物组织与细胞的破碎：生物制品大部分存在于生物组织或细生物组织与细胞的破碎：生物制品大部分存在于生物组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要的。常用的破碎方胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要的。常用的破碎方法：法： v定义：细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方定义：细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏法来破坏细胞壁细胞壁或或细胞膜细胞膜v目的：目的：破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释放出来，破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释放出来，获得有效的提取。获得有效的提取。细胞破碎是生物大分子

4、初级分离纯化的第一步，也是一个细胞破碎是生物大分子初级分离纯化的第一步，也是一个重要环节，它直接影响了产物的加收率及纯度重要环节，它直接影响了产物的加收率及纯度l动物细胞动物细胞: 多分泌到细胞外培养液多分泌到细胞外培养液l植物细胞植物细胞: 多为胞内产物多为胞内产物l微生物（细菌微生物（细菌/真菌）真菌）: 胞内、胞外胞内、胞外 l对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。l大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。基酸等目标产物存在于发酵液中。l有些目标产物存在于生物体中。有些目

5、标产物存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。细胞内沉积。脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。提取提取细胞破碎细胞破碎溶剂溶剂溶剂层溶剂层不溶性物质不溶性物质沉淀沉淀离心离心l通过机械运动所产生的通过机械运动所产生的剪切力剪切力的作用，使的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。细胞破碎的方法称为机械破碎法。l常用的仪器常用的仪器高速组织捣碎机高速组织捣碎机匀浆器匀浆器研磨器研磨器l 研杆研杆管管几百微米的间隙l l通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，通过各种物理因素的作用，使组织细

6、胞破碎的方法，统称为物理破碎方法。统称为物理破碎方法。l物理破碎方法多用于物理破碎方法多用于微生物细胞微生物细胞的破碎。的破碎。物理破碎法物理破碎法温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法压力差破碎法超声波破碎法超声波破碎法l化学破碎方法：通过化学试剂的作用，使细胞膜化学破碎方法：通过化学试剂的作用，使细胞膜的结构改变或破坏，使细胞膜的透过性改变。的结构改变或破坏，使细胞膜的透过性改变。l常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。大类。l十二烷基硫酸钠：十二烷基硫酸钠：SDSl酶学破碎方法：酶学破碎方法：利用利用溶解细胞壁溶解细胞壁的酶的酶( (外加

7、的或细胞本外加的或细胞本身存在的酶身存在的酶) )处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压、冲击等方法破坏细胞膜再利用渗透压、冲击等方法破坏细胞膜l分为：外加酶制剂和自溶法。分为：外加酶制剂和自溶法。l 自溶作用是利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加自溶作用是利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。其他的酶。l在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。物的酶，以便生长过程继续下去。l自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发自溶作用：

8、改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。l缺点：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘缺点：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。度增大，过滤速度下降。（2 2）提取（）提取（extraction） 生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取时，首先生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取时，首先要根据活性物质的性质，要根据活性物质的性质， 选择提取试剂选择提取试剂。提取试剂主要有：水、缓冲溶液。提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如

9、氯仿、丙酮等）。、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙酮等）。 考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间。 注意提取的温度、注意提取的温度、pHpH、变性剂等因素。、变性剂等因素。 包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有：包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有： 1.1.沉淀法：蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原理是使蛋白质胶体颗粒破沉淀法：蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、坏，从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、选择性沉淀法等

10、。选择性沉淀法等。 (2) (2) 按分子大小分离的方法：有超滤法和透折按分子大小分离的方法：有超滤法和透折法、凝胶层析法、超速离心法等。其中膜分离法、凝胶层析法、超速离心法等。其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。 (3)(3)按分子所带电荷进行分离的方法按分子所带电荷进行分离的方法氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它们氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它们具有具有等电点等电点，在离开等电点的，在离开等电点的pHpH时便会带正或负电荷时便会带正或负电荷。例如某蛋白质等电点为。例如某蛋白质等电点为7.07.0，当溶液，当溶液pH

11、pH为为4.04.0时，分时，分子则带有正电荷。由于具有该性质，利用带电性质进行子则带有正电荷。由于具有该性质，利用带电性质进行分离是极其有效的方法。利用电学性质进行分离的方法分离是极其有效的方法。利用电学性质进行分离的方法有有离子交换层析离子交换层析、电泳法电泳法、等电点聚焦法等电点聚焦法等。等。（4 4）亲和层析法）亲和层析法l大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物（或大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶与底物（或抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体等，它们之间有特异的抑制剂）、抗原与抗体、激素与受体等，它们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层亲合作

12、用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。析。l亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛亲和层析分离专一性强，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。的分离方法之一。l核酸类药物生产方法主要有提取法和发酵法。核酸类药物生产方法主要有提取法和发酵法。提取法生产提取法生产DNADNA和和RNARNA，先提取核酸和蛋白质复合物先提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与蛋白质，再解离核酸与蛋白质，然后分离，然后分离RNARNA与与DNADNA。发酵。发酵法主要用于生产法主要用于生产单核苷酸。 由于各种糖类制品的性质和原料来源由于各种糖类制品的性质和原料来源不同，没有统一规范的提取和纯化工

13、艺。不同，没有统一规范的提取和纯化工艺。这里只介绍多糖和粘多糖的一般分离纯化这里只介绍多糖和粘多糖的一般分离纯化方法。方法。 非降解法适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘非降解法适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液。多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液。 降解法适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖。如降解法适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖。如从软骨中分离提取硫酸软骨素，就是用碱处理进行降解。从软骨中分离提取硫酸软骨素，就是用碱处理进行降解。又如用酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖。又如用酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖。 常用的分离方法是沉淀法和离子交换层

14、析法。常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法。l 乙醇沉淀法：是从提取液中沉淀多糖的最简易方法乙醇沉淀法：是从提取液中沉淀多糖的最简易方法，也适用于分级分离。，也适用于分级分离。4-54-5倍体积的乙醇可以使任何倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉淀。用季铵化合物也可结缔组织中的粘多糖完全沉淀。用季铵化合物也可沉淀粘多糖。粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表沉淀粘多糖。粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面活性剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基面活性剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基铵（铵（CTACTA）等。）等。 （1 1）提取方法（）提取方法（extraction extract

15、ion ） 脂类自然状态下是以结合形式存在的。非极性脂类自然状态下是以结合形式存在的。非极性脂是与其他脂质分子或蛋白质分子的疏水区相结合脂是与其他脂质分子或蛋白质分子的疏水区相结合的。提取脂质就是要选择适当的溶剂来破坏这种结的。提取脂质就是要选择适当的溶剂来破坏这种结合键，将脂质溶解出来。常用的溶剂有组合溶剂，合键，将脂质溶解出来。常用的溶剂有组合溶剂，醇是其中的主要成分，此外还有氯仿、甲醇、水等醇是其中的主要成分，此外还有氯仿、甲醇、水等。 l沉淀法沉淀法 ：由于不同脂质在丙酮中溶解度不同，故常：由于不同脂质在丙酮中溶解度不同，故常用它进行沉淀。用它进行沉淀。l吸附层析法：常用吸附剂有硅胶、

16、氧化铝等。它是吸附层析法：常用吸附剂有硅胶、氧化铝等。它是通过极性和离子力等把各种化合物结合到固体吸附通过极性和离子力等把各种化合物结合到固体吸附剂上。洗脱一般是采用极性逐渐增大的洗脱液来进剂上。洗脱一般是采用极性逐渐增大的洗脱液来进行，非极性的先流出，极性的后流出行，非极性的先流出，极性的后流出。 l离子交换层析法离子交换层析法: : 脂质分子的存在有非解离、脂质分子的存在有非解离、两性离子和酸式解离三种状态两性离子和酸式解离三种状态。根据它们在一。根据它们在一定定pHpH条件下的解离情况，选择适当的条件下的解离情况，选择适当的离子交换离子交换剂剂可将它们提纯。如可将它们提纯。如TEAETE

17、AE纤维素对分离脂肪纤维素对分离脂肪酸和胆汁酸等特别有效。酸和胆汁酸等特别有效。 （1）氨基酸的生产方法）氨基酸的生产方法l蛋白质水解法：水解法有酸水解、碱水解和酶蛋白质水解法：水解法有酸水解、碱水解和酶水解三种。水解三种。 用盐酸水解为常用方法，其优点是水解迅用盐酸水解为常用方法，其优点是水解迅速、完全，产物全部是速、完全，产物全部是L L型氨基酸，缺点型氨基酸，缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等部分被破坏。是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等部分被破坏。碱水解法易产生消旋作用，较少应用。碱水解法易产生消旋作用，较少应用。酶水解法水解不够完全。酶水解法水解不够完全。 l发酵法：发酵法：菌株经过发酵后，

18、从培养液中提纯氨基酸。菌株经过发酵后，从培养液中提纯氨基酸。 l化学合成与酶促合成法化学合成与酶促合成法化学合成法化学合成法一般得到的是一般得到的是DL型氨基酸，尚需型氨基酸，尚需要对异构体拆分；要对异构体拆分；酶促合成法酶促合成法也是酶工程在医药工也是酶工程在医药工业上的应用，优点是技术工艺简单，转化率高，副业上的应用，优点是技术工艺简单，转化率高，副产物少和易提纯等。产物少和易提纯等。 有沉淀法、吸附法和离子交换法。有沉淀法、吸附法和离子交换法。l沉淀法：根据形成沉淀的原理不同分为两种：是依据沉淀法：根据形成沉淀的原理不同分为两种：是依据不同氨基酸在水中或其他溶剂中的溶解度差异进行沉淀不同

19、氨基酸在水中或其他溶剂中的溶解度差异进行沉淀分离。是用特殊试剂沉淀某种氨基酸，如用邻二甲苯分离。是用特殊试剂沉淀某种氨基酸，如用邻二甲苯-4-磺酸与亮氨酸形成不溶性盐沉淀，再用氨水分解，使磺酸与亮氨酸形成不溶性盐沉淀，再用氨水分解，使亮氨酸游离出来亮氨酸游离出来。l 吸附法：这是利用吸附剂根据氨基酸吸附力的差吸附法：这是利用吸附剂根据氨基酸吸附力的差异进行氨基酸分离的方法。苯丙氨酸、酪氨酸、色异进行氨基酸分离的方法。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分离就是利用活性炭对其吸附的原理。氨酸的分离就是利用活性炭对其吸附的原理。l 离子交换法：氨基酸是两性电解质，在一定离子交换法：氨基酸是两性电解质，在一定

20、pHpH条条件下，不同氨基酸带电性质及解离状态是不相件下，不同氨基酸带电性质及解离状态是不相同的，因此在离子交换剂上被吸附的强度不同同的，因此在离子交换剂上被吸附的强度不同。常用的离子交换剂为强酸型阳离子交换树脂。常用的离子交换剂为强酸型阳离子交换树脂，洗脱主要用，洗脱主要用pHpH梯度洗脱。梯度洗脱。 l基因工程产物的特点：基因工程产物的特点： 产物大多数处于细胞内，需进行细胞破碎产物大多数处于细胞内，需进行细胞破碎 产物浓度较低，杂质多，提纯困难产物浓度较低，杂质多，提纯困难1. 产物多是大分子蛋白质，通常不稳定，易失活产物多是大分子蛋白质，通常不稳定，易失活 1、含目的产物的起始物料的特

21、点、含目的产物的起始物料的特点 各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。 这些因素包括：这些因素包括：菌种类型及其代谢特性。包括菌种的各种生物学性质，产物和菌种类型及其代谢特性。包括菌种的各种生物学性质，产物和副产物种类、产物在细胞内所处的位置，表达方式，代谢物种类副产物种类、产物在细胞内所处的位置，表达方式，代谢物种类，产物类似物、毒物和能降解产物的酶类等；，产物类似物、毒物和能降解产物的酶类等；原材料和培养基的来源及其质量；原材料和培养基的来源及其质量；生产工艺和条件。包括灭菌方法和条件，生产方式（连生产工艺和条件。包括灭菌方法和条件，生产方式（

22、连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条件、因素及方式等；件、因素及方式等；初始物料的物理、化学和生物学特性。包括产物浓度、主初始物料的物理、化学和生物学特性。包括产物浓度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、粘度、粘度、流体力学性质和热力学性质等。、流体力学性质和热力学性质等。2、物料中杂质的种类和性质、物料中杂质的种类和性质l杂质种类和性质包括相关性和非相关性杂质杂质种类和性质包括相关性和非相关性杂质的含量、化学性质、结构、相对分子量、电荷的含量、化学性质、结构、相对分子量

23、、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。分配系数、挥发性、吸附性能等。3、目的产物特性、目的产物特性l产物特性主要有化学、物理和生物学特性产物特性主要有化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子质量、等电点、，包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等。性等。 4、产品质量的要求、产品质量的要

24、求l产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。包括允许的杂质种类和最大允、比活的要求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。二、分离纯化的基本过程二、分离纯化的基本过程l分离纯化是极其重要的一环，这是由于工程菌经过分离纯化是极其重要的一环，这是由于工程菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很低，杂质含量大规模培养后，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高；却很高；l另外由于基因工程药物是从转化细胞、

25、不是从另外由于基因工程药物是从转化细胞、不是从正常细胞生产的，对产品的纯度要求也高于传统正常细胞生产的，对产品的纯度要求也高于传统产品。分离纯化要比传统产品困难得多。产品。分离纯化要比传统产品困难得多。l分离纯化一般不应超过分离纯化一般不应超过4 45 5个步骤，包个步骤，包括细胞破碎括细胞破碎 、固液分离、浓缩与初步纯、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离包含体细胞碎片分离变性复性浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品l1 1、根据产物表达形式来选择、根据产物表达形式来选择分泌型表达产物分

26、泌型表达产物的发酵液的体积很大、但浓度的发酵液的体积很大、但浓度较低，必须在纯化前进行浓缩，可用较低，必须在纯化前进行浓缩，可用沉淀和超沉淀和超滤滤的方法浓缩。的方法浓缩。 l产物在产物在周质表达周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌是介于细胞内可溶性表达和分泌表达之间的一种形式，它可以避开细胞内可溶性蛋表达之间的一种形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于分白和培养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于分离纯化。离纯化。l为了获得为了获得周质蛋白周质蛋白，E.coliE.coli经低浓度溶菌酶处理经低浓度溶菌酶处理后，可采用后，可采用渗透压裂解渗透压裂解的方法来获得

27、，能够回收到的方法来获得，能够回收到高质量的产物。高质量的产物。 lE.coliE.coli细胞内可溶性表达产物破菌后的细细胞内可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法。如果没有可以胞上清，首选亲和分离方法。如果没有可以利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基，一般先用离子交换色谱，处于极端等电点，一般先用离子交换色谱，处于极端等电点的蛋白质用离子交换分离能去掉大部分的杂的蛋白质用离子交换分离能去掉大部分的杂质。质。l应选择不同机制的分离单元来组成一套应选择不同机制的分离单元来组成一套分离纯化工艺，尽早采用高效的分离手分离纯化工艺，尽早采用高效的分离

28、手段，先将含量最多的杂质分离去除，将段，先将含量最多的杂质分离去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段。阶段。l即通常：即通常：l先选用非特异、低分辨的操作单元（如沉先选用非特异、低分辨的操作单元（如沉淀、超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积淀、超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要的杂质（包括，提高产物浓度，去除最主要的杂质（包括非蛋白类杂质）；非蛋白类杂质）；l随后采用高分辨率的操作单元（如具有高选随后采用高分辨率的操作单元（如具有高选择性的离子交换色谱和亲和色谱）；择性的离子交换色谱和亲和色谱）；l凝胶排阻色谱这类分离规模小、分

29、离速度慢的凝胶排阻色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后。操作单元放在最后。 l色谱分离次序的选择同样重要色谱分离次序的选择同样重要l色谱次序能够提高分离效率，当几种方法连用时，色谱次序能够提高分离效率，当几种方法连用时，最好以不同的分离机制为基础，经前一种方法处理的最好以不同的分离机制为基础，经前一种方法处理的样品应能适合于作为后一种方法的料液，不必经过脱样品应能适合于作为后一种方法的料液，不必经过脱盐、浓缩等处理。盐、浓缩等处理。l如经盐析后得到的样品，不适宜于离子交换层析，如经盐析后得到的样品，不适宜于离子交换层析，但对疏水层析则可直接应用。但对疏水层析则可直接应用。 l离子交

30、换、疏水及亲和色谱通常可起到蛋离子交换、疏水及亲和色谱通常可起到蛋白质浓缩的效应白质浓缩的效应l凝胶过滤色谱常常使样品稀释凝胶过滤色谱常常使样品稀释l在离子交换色谱之后进行疏水层析色谱就很在离子交换色谱之后进行疏水层析色谱就很合适，不必经过缓冲液的更换合适，不必经过缓冲液的更换l亲和层析选择性最强，但不能放在第一步：一亲和层析选择性最强，但不能放在第一步：一方面因为杂质多，易受污染，另一方面，体积较方面因为杂质多，易受污染，另一方面，体积较大，需用大量的介质，因此亲和层析多放在第二大，需用大量的介质，因此亲和层析多放在第二步以后。步以后。分离纯化的技术分离纯化的技术l分离纯化技术应满足下列要求

31、：分离纯化技术应满足下列要求：技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；选择性要好，达到较高纯化倍数；选择性要好，达到较高纯化倍数；收率要高；收率要高；要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整；要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整；整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。 分离纯化工艺应遵循以下原则：分离纯化工艺应遵循以下原则：l（1 1）工艺条件应温和，具有良好的稳定性和重复性）工艺条件应温和，具有良好的稳定性和重复性：不受或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响，在：不受或少受发酵工艺、条件及原

32、材料来源的影响，在任何环境下使用都应具有重复性，明确需严格控制的步任何环境下使用都应具有重复性，明确需严格控制的步骤和技术骤和技术l（2 2）尽可能减少组成工艺的步骤：步骤越多，产品）尽可能减少组成工艺的步骤：步骤越多，产品的后处理收率越低，但必须保证产品的质量的后处理收率越低，但必须保证产品的质量l（3 3）组成工艺的各技术或步骤之间要相互适应和协）组成工艺的各技术或步骤之间要相互适应和协调调l（4 4）在工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加）在工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加步骤，或干扰产品质量步骤，或干扰产品质量l（5 5）时间要尽可能短，因稳定性差的产物随工艺时）时间要尽可能短，因

33、稳定性差的产物随工艺时间增加，生物活性收率会降低，产品质量会下降间增加，生物活性收率会降低，产品质量会下降l（6 6）必须高效、收率高、易操作，对设备条件）必须高效、收率高、易操作，对设备条件要求低，能耗低要求低，能耗低l（7 7）具有较高的安全性：药品必须保证安全、无）具有较高的安全性：药品必须保证安全、无菌、无热原、无污染菌、无热原、无污染l（一）（一） 细胞内不溶性产物细胞内不溶性产物包含体包含体l大肠杆菌表达系统的重组小分子目的蛋白，以不溶性形式产生大肠杆菌表达系统的重组小分子目的蛋白，以不溶性形式产生并聚集形成蛋白质聚合物并聚集形成蛋白质聚合物包含体包含体l以包含体形式存在的蛋白分子

34、不具有正确的天然三维结构，以包含体形式存在的蛋白分子不具有正确的天然三维结构，表达蛋白不具有生物活性，因此表达蛋白不具有生物活性，因此在纯化过程中必须溶解包含在纯化过程中必须溶解包含体并对表达蛋白进行体并对表达蛋白进行复性复性。l步骤：细胞收集与破碎、包含体的分离、洗涤与溶解、变性蛋白质步骤：细胞收集与破碎、包含体的分离、洗涤与溶解、变性蛋白质的纯化、重组蛋白质的复性、天然蛋白质的分离的纯化、重组蛋白质的复性、天然蛋白质的分离l分泌型的表达产物通常体积较大、浓度较低，必须在纯化以分泌型的表达产物通常体积较大、浓度较低，必须在纯化以前进行浓缩前进行浓缩l浓缩方法包括：沉淀、超滤浓缩方法包括：沉淀

35、、超滤l周质表达的蛋白是介于细胞内可溶性表达和分泌型表达之间的一周质表达的蛋白是介于细胞内可溶性表达和分泌型表达之间的一种表达形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂种表达形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于蛋白产物的分离纯化。质，在一定程度上有利于蛋白产物的分离纯化。l为了获取周质蛋白，大肠杆菌细胞经低浓度溶菌酶处理后，一般为了获取周质蛋白，大肠杆菌细胞经低浓度溶菌酶处理后，一般用渗透压裂解法获取。用渗透压裂解法获取。l由于周质中的蛋白仅有为数不多的几种分泌蛋白，同时又无由于周质中的蛋白仅有为数不多的几种分泌蛋白，同时又无蛋白水解酶的污染，因此通

36、常能够回收到高质量的蛋白产物蛋白水解酶的污染，因此通常能够回收到高质量的蛋白产物。 一、原材料的质量检测与控制一、原材料的质量检测与控制l原材料的质量控制是要确保编码生物制品的原材料的质量控制是要确保编码生物制品的DNADNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。保证产品质量的安全性和一致性。 l 在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；l在培养过程中，要求工程菌所含的重组质粒稳定，始终无在培养过程中，要求工程菌所含的重组质粒稳定，始终无突变；

37、突变；l在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。外源微生物污染。l 产品应有种子批系统，并证明种子批不含致癌因产品应有种子批系统，并证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。始种子批建立生产用工作细胞库。l原始种子批须确证克隆基因原始种子批须确证克隆基因DNADNA序列，详细叙述种子序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。载体表达系统的稳定性。l产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNADNA与热与热原质都控制在规定限度以下。原质都控制在规定限度以下。l基因工程药