细菌半数致死量测定张玉晴

1、细菌细菌LD50测定方法测定方法报告人：张玉晴报告人：张玉晴指导老师：李槿年教授指导老师：李槿年教授大纲1LD50基本概念2LD50计算方法LD50具体操作步骤3注意事项4w半数致死量：LD50（Lethal dose）表示在规定时间内,通过指定感染途径,使一定体重或年龄的某种动物半数死亡所需最小细菌数或毒素量。 1LD50基本概念w1、寇氏法/改良寇氏法w2、累计法（Reed-Muench法）w3、霍恩氏法（Horn氏法）w4、加权法w5、序贯法w6、固定剂量法w7、logistic模型法LD50计算方法2w1、寇氏法/改良寇氏法 公式：LD50= lg -1Xm i (P 0.5) X50

2、=lgLD50 LD50 95%可信限=lg -1（X50 1.96SX50） LD50平均可信限=LD50 （LD50可信限高限-低限）/2 Xm：最大剂量的对数值i ：相邻两组剂量对数值之差P：各组动物死亡率，用小数表示P：各组动物死亡率之总和 n：每组动物数w预试验找出引起0%死亡率和100死亡率剂量的所在范围w反应量大致呈正态分布w剂量必须按等比级数分布w各组动物数相等w2、累计法（Reed-Muench法） 它是先将实验死亡动物数和存活动物数进行累计加和, 再用加和的数据计算死亡率。在死亡率中有2个数据A和B,且A刚好大于50%,B刚好小于50% w计算方便, 更多地运用在微生物学中

3、, 尤其在稀释分析中w不考虑操作误差, 计算结果不够精确, 粗略判断LD50。拟态弧菌对草鱼LD50的测定335%来苏尔浸泡24h自来水冲洗15432一、实验准备：二、细菌总数测定 挑取HX4单个菌落10mL生理盐水重悬100mLBHI液体培养基离心收集菌体洗涤菌体3次测量菌落大小30 150r/min振荡培养24h8000r/min离心8min平板菌落计数法计数4保存用于攻毒10-110-310-210-410-510-610-710-810-930倒置倒置培养培养24h记录平板上菌落数记录平板上菌落数量，肉眼观察量，肉眼观察+放放大镜检查大镜检查w数据处理 选取同一稀释度平均菌落数在303

4、00个之间的平板1、一个稀释度，平均菌落数在30300个之间时，乘以稀释倍数报告。2、如有两个稀释度平均菌落数均在30300个之间，则应求出两者总菌数之比，比值小于或等于2应报告平均数，大于2则报告其中较小的数字。3、如所有稀释度的平均菌落数均多于300个，应按稀释度最高的平均菌落数，乘以稀释倍数报告。 4、如所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则按稀释倍数最低的平均菌落数，乘以稀释倍数报告。5、如所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一个稀释度大于300，而相邻的另一稀释度小于30，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告。w三、攻毒0.01g/LMS-222麻醉0.3mL

5、1.210102.41094.81089.61071.9107分别腹腔注射5组鱼三、攻毒 观察7天内草鱼的发病和死亡情况，记录结果，按Reed-Muench氏法计算LD50 病死鱼无菌解剖，观察内脏病变情况，并用接种环蘸取内脏接种于BHI固体培养基上，30培养2d，对分离到的细菌进行革兰氏染色镜检。组组别别剂量CFU/mL只数死亡数 存活数累计结果(result)生死死亡比例 死亡率11.2101055014/14100.0%24.01095419/1090.0%31.31095325/862.5%44.41085232/822.2%51.51085050/110.0%LD50=4.2107CFU/mL0表1 HX4菌对斑马鱼的毒力（LD50据汇总：组别 稀释比例 死亡率1 原液 100%2 1:3 90.0%3 1:9 62.5%4 1:27 22.2%5 1:81 0.0%w7、LD50计算 距离比例r=（高于50%死亡率50）（高于50%死亡率低于50%死亡率） =（62.550）（62.522.2） =0.310 lgLD50=高于50%死亡率稀释度倒数的对数+距离比例稀释倍数的对数 =lg9+0.310lg3=1.1021 LD50=14.3515 即当细菌原液稀释成1:14.3515时，腹腔注射斑马鱼，能使50%斑马鱼发生死亡。