天津大学,生物化学,第十二章4-5节-1ppt课件

1、一、一、DNADNA指点下的指点下的RNARNA合成转录合成转录二、二、RNARNA指点下的指点下的RNARNA合成合成RNARNA复制复制三、三、RNARNA指点下的指点下的DNADNA合成逆转录合成逆转录转录：在转录：在DNADNA指点下指点下RNARNA的合成。此过程包括的合成。此过程包括RNARNA链的起始、延伸、终止等步骤。链的起始、延伸、终止等步骤。 转录要涉及两方面：一是转录要涉及两方面：一是RNARNA合成的酶学过程；合成的酶学过程；二是二是RNARNA合成的起始信号和终止信号。合成的起始信号和终止信号。模板链：转录的模板模板链：转录的模板DNADNA链，也叫反义链或负链。链，

2、也叫反义链或负链。编码链：与模板链对应的链，也叫有义链或正链。编码链：与模板链对应的链，也叫有义链或正链。转录的起始是由转录的起始是由DNADNA的启动子的启动子promterpromter区控制区控制的，而控制终止的部位那么称为终止子的，而控制终止的部位那么称为终止子(ferminafor)(ferminafor)。一大肠杆菌一大肠杆菌RNARNA聚合酶聚合酶二二RNARNA聚合酶催化的转录过程聚合酶催化的转录过程 三三RNARNA的转录后加工的转录后加工 +中心酶PPPPP- P- P53PPPPPDNADNA指点下的指点下的RNARNA合成合成1 1RNARNA聚合酶与模板聚合酶与模板D

3、NADNA结合结合 2 2起始起始 3 3延伸延伸 4 4终止终止RNARNA聚合酶结合到模板聚合酶结合到模板DNADNA的特定位置上的特定位置上 这一特定部位有这一特定部位有RNARNA聚协作用的起动聚协作用的起动基因，即启动子基因，即启动子TTGACAAACTGTTATAATATATTA3535识别位识别位1010PribnowPribnow框框1 1起始部位起始部位DNA53原核生物启动子构造原核生物启动子构造双链双链DNADNA部分解开部分解开磷酸二酯键的构成磷酸二酯键的构成1 1PPPPP- P- P53PPPPP磷酸二酯键的构成磷酸二酯键的构成2 2恢复的恢复的DNADNA双螺旋双

4、螺旋mRNAmRNA5延伸阶段延伸阶段1 1 在在DNADNA的一条链上，经过碱基配对的一条链上，经过碱基配对合成合成RNARNA链，解链区沿链，解链区沿DNADNA挪动挪动延伸阶段延伸阶段2 2解链区到达基因终端解链区到达基因终端终止阶段终止阶段1 1RNARNA和和RNARNA聚合酶从聚合酶从DNADNA上零落上零落终止阶段终止阶段2 2：原核生物转录中止信号及产：原核生物转录中止信号及产物物AGCCCGCTCGGGCGGCGGGCTCGCCCGATTTTTTTTAAAAAAAA反义链反义链有义链有义链DNAAAAAAAAATTTTTTTTUUUUUUUCGGGCGGCCCGCA5反义链反

5、义链有义链有义链DNARNA产物产物 在细胞内，由在细胞内，由RNARNA聚合酶合成的原初聚合酶合成的原初转录物往往需求经过一系列的变化，包转录物往往需求经过一系列的变化，包括链的裂解、括链的裂解、5 5端与端与3 3端的切除和特殊构端的切除和特殊构造的构成，碱基修饰和糖苷键的改动，造的构成，碱基修饰和糖苷键的改动，以及拼接等过程。使其能转变为成熟的以及拼接等过程。使其能转变为成熟的RNARNA分子，此过程总称为分子，此过程总称为RNARNA的成熟或转的成熟或转录后加工。录后加工。 1 1原核生物原核生物RNARNA的转录后加工的转录后加工 2 2真核细胞真核细胞RNARNA的转录后加工的转录

6、后加工 原核生物的原核生物的mRNAmRNA大多不需加工，一经转大多不需加工，一经转录即可直接进展翻译。录即可直接进展翻译。 大肠杆菌共有大肠杆菌共有7 7个个rRNArRNA的转录单位，它的转录单位，它们分散在基因组的各处。们分散在基因组的各处。 P16SP16SP23SP23SP5SP5S16S16S23S23S5S5S细菌细菌rRNArRNA的构成的构成 大肠杆菌染色体基因组共有大肠杆菌染色体基因组共有tRNAtRNA基基因约因约6060个，这个数字远大于按变偶假说个，这个数字远大于按变偶假说所要求的反密码子数。即：某些反密码所要求的反密码子数。即：某些反密码子能够不只一个子能够不只一个

7、tRNAtRNA分子，或某些分子，或某些tRNAtRNA基因不是一个拷贝。基因不是一个拷贝。tRNAtRNA基因大多成簇基因大多成簇存在。存在。tRNAtRNA转录时首先成为转录时首先成为tRNAtRNA前体。前体。 5ppp转录转录tRNAtRNA前体前体tRNAtRNAOH35pppOH3OH3+核苷核苷酸降解产物酸降解产物降解至单降解至单核苷酸核苷酸p成熟的成熟的tRNAtRNAUGm2GAi6A等等修饰修饰tRNAtRNA的构成的构成RNA聚合聚合酶的种类酶的种类功能功能所在所在I IrRNArRNA的前体的前体核仁核仁IIIImRNAmRNA的前体的前体核质核质IIIIII5SrRN

8、A5SrRNA、tRNAtRNA、及其他多种、及其他多种小分子核仁和核浆小分子核仁和核浆RNARNA前体前体核质核质18S18S5.8S5.8S28S28S45S45S甲基化作用甲基化作用核酸内切酶核酸内切酶18S18SRNARNA5.8S5.8SRNARNA28S28SRNARNA真核生物真核生物rRNArRNA前体的加工前体的加工真核生物真核生物rRNArRNA的生成与成熟的生成与成熟45S 45S 5S5S41S32S41S32S 5S 20S 5S 20S32S 32S 5S5S细胞核细胞核核仁核仁细胞质细胞质28S 28S 5.8S5.8S18S 18S 5S 5S 28S 28S

9、5.8S5.8S18S 18S 核蛋白体核蛋白体在酶的催化下，切掉部分核苷酸分子包在酶的催化下，切掉部分核苷酸分子包括括1414分子的分子的UMPUMP、7 7分子分子CMPCMP、8 8分子分子GMPGMP及少于及少于1 1分子的分子的AMPAMP。tRNAtRNA前体分子被修饰：其一是有些尿嘧啶前体分子被修饰：其一是有些尿嘧啶残基转变为拟尿嘧啶或二氢尿嘧啶残基；其二残基转变为拟尿嘧啶或二氢尿嘧啶残基；其二是甲基化作用。此变化是在甲基转移酶的催化是甲基化作用。此变化是在甲基转移酶的催化下，由下，由s-s-腺苷蛋氨酸供应甲基，在多核苷酸程腺苷蛋氨酸供应甲基，在多核苷酸程度上进展。度上进展。 从

10、从tRNAtRNA前体转变到前体转变到tRNAtRNA的过程的过程tRNAtRNA的生成的生成细胞核细胞核核仁核仁细胞质细胞质tRNAtRNA基因基因转录转录5切断切断tRNAtRNA前体前体nCH3拟尿苷生成拟尿苷生成tRNAtRNA两者都为不均一分子两者都为不均一分子两者碱基组成上有部分类似两者碱基组成上有部分类似两者两者3 3末端都有多聚腺苷酸尾部；末端都有多聚腺苷酸尾部；5 5端衔端衔接有接有GMTPGMTP7-7-甲基鸟苷的帽子甲基鸟苷的帽子1 1细胞核中的不均一核细胞核中的不均一核RNARNAHnRNAHnRNA能够是能够是mRNAmRNA的前体的前体, ,由于：由于：5 5端构成

11、特殊的帽子构造端构成特殊的帽子构造M7G5M7G5PPP5PPP5NmpNp-NmpNp-在链的在链的3 3端切断并加上多聚腺端切断并加上多聚腺苷酸苷酸polyApolyA尾巴尾巴经过拼接除去由内含子转录来经过拼接除去由内含子转录来的序列的序列链内部核苷被甲基化链内部核苷被甲基化2 2HnRNAHnRNA转变成转变成mRNAmRNA的加工过程：的加工过程：卵清蛋白基因产生卵清蛋白基因产生mRNAmRNA的过程：的过程：转录转录1 2 3 4 5 6 7 A B C D E F G 卵清蛋白基因卵清蛋白基因(7700(7700个核苷酸个核苷酸) )1 2 3 4 5 6 7 A B C D E

12、F G LL5 53 3加帽子和尾巴加帽子和尾巴1 2 3 4 5 6 7 A B C D E F G L5 53 3内含子内含子RNA的除去的除去 和拼接作用和拼接作用12345 6 7 LCAPCAPPolyAPolyA尾尾成熟的成熟的mRNAmRNA18721872个核苷酸个核苷酸GTPPipppN1N2N3G5 ppp5 N1N2N3 pppN1N2N3 RNARNA三磷酸酶三磷酸酶PiimRNAmRNA鸟苷酸鸟苷酸转移酶转移酶S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸m7G5 ppp5 N1N2N3 S-腺苷高半胱氨酸腺苷高半胱氨酸mRNA(mRNA(鸟嘌呤鸟嘌呤-7-)-7-)甲基转移酶甲基转移

13、酶mRNA(mRNA(核苷核苷-2-2-)-)甲基转移酶甲基转移酶S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸S-腺苷高半胱氨酸腺苷高半胱氨酸m7G5 ppp5 N1 mN2N3 S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸S-腺苷高半胱氨酸腺苷高半胱氨酸m7G5 ppp5 N1 mN2mN3 mRNA(mRNA(核苷核苷-2-2-)-)甲基转移酶甲基转移酶病毒正链具病毒正链具mRNAmRNA功能功能pppG5 3 OH5 5 pp3 OH复制中间体复制中间体5 3 3 新合成的负链新合成的负链病毒正链为模板病毒正链为模板复制酶复制酶5 19701970年年TeminTemin和和BaltimoreBaltimore同时分别

14、从致癌同时分别从致癌RNARNA病毒中发现病毒中发现RNARNA指点的指点的DNADNA聚合酶。由于它催化聚合酶。由于它催化遗传信息从遗传信息从RNARNA流向流向DNADNA，与转录作用正好相反，与转录作用正好相反，故称为反转录酶或逆转录酶。，故称为反转录酶或逆转录酶。病毒感染细胞后，经过逆转录酶生成与病毒病毒感染细胞后，经过逆转录酶生成与病毒RNARNA碱基序列互补的碱基序列互补的DNADNA，并整合到宿主细胞的，并整合到宿主细胞的染色体染色体DNADNA中。以后，在宿主细胞内，这段插中。以后，在宿主细胞内，这段插入的入的DNADNA经转录生成相应的经转录生成相应的mRNAmRNA，再转译

15、成病，再转译成病毒专注的蛋白质。毒专注的蛋白质。 RNA3 5 依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶聚合酶RNA3 5 核糖核酸酶核糖核酸酶H53 53 cDNA依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶cDNA杂种分子杂种分子35 53 双链双链DNA新合成的双链新合成的双链DNA整合到整合到寄主染色体寄主染色体DNA中中DNADNA重组技术是指将不同的重组技术是指将不同的DNADNA片段按人们的片段按人们的设计方案定向地衔接起来，并在特定的受体细设计方案定向地衔接起来，并在特定的受体细胞中，与载体一同得到复制与表达，使受体细胞中，与载体一同得到复制与表达，使受体细胞获得新的遗传特性。胞获得新的遗传

16、特性。从某种意义上来说，从某种意义上来说，DNADNA重组技术也可了解重组技术也可了解为基因工程，也是使生物基因构造得到改造的为基因工程，也是使生物基因构造得到改造的技术。技术。 一、一、DNADNA重组技术的用途重组技术的用途 二、重组中所用的酶和载体二、重组中所用的酶和载体三、重组的大致步骤三、重组的大致步骤1 1利用利用DNADNA重组技术大量消费一些在正常组重组技术大量消费一些在正常组织代谢中产量很低的多肽物质，如多肽激素、织代谢中产量很低的多肽物质，如多肽激素、多肽抗生素、酶类、抗体及各种肽类。多肽抗生素、酶类、抗体及各种肽类。2 2定向地改造生物基因组构造，使其具有定向地改造生物基

17、因组构造，使其具有的某些有经济价值的功能得以成百倍地提高。的某些有经济价值的功能得以成百倍地提高。3 3将将DNADNA重组技术运用于根底研讨。如在基重组技术运用于根底研讨。如在基因组构造及基因组功能调理的研讨。因组构造及基因组功能调理的研讨。一一DNADNA体外重组中常用的酶体外重组中常用的酶 二载体二载体 1 1限制性内切酶限制性内切酶2 2T4DNAT4DNA衔接酶衔接酶3 3大肠杆菌大肠杆菌 DNADNA聚合酶聚合酶I I4 4大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶大片段聚合酶大片段klenowklenow片段片段5 5T4DNAT4DNA聚合酶聚合酶6 6T4T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶

18、7 7反转录酶反转录酶8 8细菌碱性磷酯酶细菌碱性磷酯酶9 9核酸酶核酸酶S1S11010脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶I I1111polyApolyA聚合酶聚合酶 由同一个限制性内切酶切断得到由同一个限制性内切酶切断得到的任何两个的任何两个DNADNA片段的粘性末端都片段的粘性末端都可以相互配对，然后每条可以相互配对，然后每条DNADNA链的链的断开部分再经过断开部分再经过DNADNA衔接酶所产生衔接酶所产生的磷酸二酯键衔接起来。的磷酸二酯键衔接起来。1.1.限制性内切酶限制性内切酶1 1 1.1.限制性内切酶限制性内切酶2 2 酶酶（产生平头末端）（产生平头末端）限制和修饰部位限制和修饰部

19、位来源来源 HindII5-G-T-Py-Pu-A-C-3 3-C-A-Pu-Py-T-G-5流感嗜血菌流感嗜血菌 HindI 5-G-T-T-A-A-C-3 3-C-A-A-T-T-G-5副流感副流感嗜血菌嗜血菌* 酶酶（产生粘性末端）（产生粘性末端）限制和修饰部位限制和修饰部位来源来源 EcoRI 5-G-A-A-T-T-C-3 3-C-T-T-A-A-G-5流感嗜血菌流感嗜血菌EcoRII 5-N-C-C-N-G-G-N-3 3-N-G-G-N-C-C-N-5大肠杆菌大肠杆菌EcoRIII 5-A-A-G-C-T-T-3 3-T-T-C-G-A-A-5流感嗜血菌流感嗜血菌* 1.1.限制

20、性内切酶限制性内切酶3 3 2 2T4DNAT4DNA衔接酶：是从噬菌体衔接酶：是从噬菌体T4 T4 感染过的大肠感染过的大肠杆菌中分别出来的。此酶由一条肽链组成，分子杆菌中分别出来的。此酶由一条肽链组成，分子量量68006800，催化，催化DNADNA上的上的3 3-OH-OH与与5 5-P-P末端之间的磷末端之间的磷酸二酯键的构成，既可催化粘性末端又可催化平酸二酯键的构成，既可催化粘性末端又可催化平头末端间的衔接。催化过程需头末端间的衔接。催化过程需ATPATP和和Mg2+Mg2+3 3大肠杆菌大肠杆菌 DNA DNA聚合酶聚合酶I I：5 5-3-3聚合酶活力聚合酶活力4 4大肠杆菌大肠

21、杆菌DNADNA聚合酶大片段聚合酶大片段klenowklenow片段片段：将大肠杆菌：将大肠杆菌DNADNA聚合酶用枯草杆菌素来降解，聚合酶用枯草杆菌素来降解，构成的产物中有一个分子量为构成的产物中有一个分子量为76,00076,000的多肽，即的多肽，即为此酶。它失去了为此酶。它失去了5 5-3-3外切酶活力，其它功能与外切酶活力，其它功能与DNADNA聚合酶一样，此酶用途很广。聚合酶一样，此酶用途很广。 5 5T4DNAT4DNA聚合酶：它存在于噬菌体聚合酶：它存在于噬菌体T4T4中，与中，与klenowklenow片段类似，片段类似，5 5-3-3聚合酶活力比大肠杆菌聚合酶活力比大肠杆菌

22、DNADNA酶多酶多200200倍。倍。6 6T4T4多核苷酸激酶：此酶是从多核苷酸激酶：此酶是从T4T4感染过的大感染过的大肠杆菌中分别出来的，它催化肠杆菌中分别出来的，它催化ATPATP上的上的-P-P转移转移到到DNADNA或或RNARNA的的5 5-OH-OH上，所以可用来标志上，所以可用来标志DNADNA或或RNARNA。7 7反转录酶：合成反转录酶：合成cDNAcDNA的第一条链，具有的第一条链，具有5 5- -3 3DNADNA聚合酶活力。聚合酶活力。 8 8细菌碱性磷酯酶：非常耐热，可将细菌碱性磷酯酶：非常耐热，可将DNADNA或或RNARNA的的5 5-P-P除去，反响常在除

23、去，反响常在600C600C以上进展，以以上进展，以抑制反响中其他内切酶。抑制反响中其他内切酶。9 9核酸酶核酸酶S1S1：催化单链：催化单链DNADNA降解，产生降解，产生5 5-P-P结尾的单核苷酸或寡核苷酸，用以切除双链结尾的单核苷酸或寡核苷酸，用以切除双链cDNAcDNA上的发夹形构造上的单链凸环。上的发夹形构造上的单链凸环。1010脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶I I：是一种内切酶，降：是一种内切酶，降解双链或单链解双链或单链DNADNA，产生以，产生以5 5-P-P结尾的单核苷结尾的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。酸及寡核苷酸的混合物。1111polyApolyA聚合酶：催化将聚合酶：催

24、化将AMPAMP加到加到RNARNA的的3 3- -OHOH末端，构成末端，构成3 3-polyA-polyA的反响。的反响。 1 1定义定义2 2载体必需具备的条件载体必需具备的条件 3 3目前常用的载体目前常用的载体 外源外源DNADNA片段要进入受体细胞，并片段要进入受体细胞，并在其中进展复制与表达，必需有一个在其中进展复制与表达，必需有一个适当的运载工具将其带入细胞内，并适当的运载工具将其带入细胞内，并载着外源载着外源DNADNA一同进展复制与表达，这一同进展复制与表达，这种运载工具称为载体种运载工具称为载体 。 1 1在受体细胞中，可以独立进展复在受体细胞中，可以独立进展复制，所以其

25、本身必需是一个复制单位，制，所以其本身必需是一个复制单位，而且插入外源而且插入外源DNADNA后不会影响其本身的后不会影响其本身的复制才干。复制才干。2 2易于鉴定、挑选。即易将带有外易于鉴定、挑选。即易将带有外源源DNADNA的重组体与正常的载体区别开。的重组体与正常的载体区别开。3 3易于引入受体细胞。易于引入受体细胞。 1质粒：是比较小的双链质粒：是比较小的双链DNA环形环形分子，在细菌和酵母中都存在。分子，在细菌和酵母中都存在。2 2噬菌体：包括噬菌体：包括噬菌体、装配型噬菌体、装配型质粒质粒噬菌体改造及噬菌体改造及 M13 M13噬菌体噬菌体是一种含有单链是一种含有单链DNADNA的

26、噬菌体。的噬菌体。 DNADNA用限制酶除用限制酶除去中间一段去中间一段太小不能太小不能被包装被包装与外源与外源DNADNA衔接衔接重组重组DNADNA分子的体外包装分子的体外包装带有外源带有外源DNADNA的的噬菌体噬菌体1 1外源外源DNADNA与载体的衔接，构成重组与载体的衔接，构成重组DNADNA2 2经过转化或感染将重组经过转化或感染将重组DNADNA引入引入受体细胞受体细胞3 3挑选出含有重组体的阳性克隆挑选出含有重组体的阳性克隆 简明简明P235P235图图12121313、12121414载体载体外源基因外源基因含有不同插入含有不同插入DNADNA片断的质粒片断的质粒细菌细胞细

27、菌细胞转化并置于有抗生素的介质转化并置于有抗生素的介质带有抗药性质粒带有抗药性质粒的细菌才生长的细菌才生长鉴定携有鉴定携有DNADNA片断克隆的片断克隆的的菌落，并扩展培育的菌落，并扩展培育质粒质粒DNADNA纯化纯化1 1目的基因的获得目的基因的获得2 2外源外源DNADNA与载体的衔接，构成与载体的衔接，构成 重组重组DNADNA3 3将重组将重组DNADNA引入受体细胞引入受体细胞4 4重组体的挑选重组体的挑选5 5表达表达 待插入的待插入的外源外源DNADNA质粒载体质粒载体衔接衔接重组体重组体DNADNA经转化作用或病毒经转化作用或病毒感染引入宿主细胞感染引入宿主细胞宿主染宿主染色体

28、色体挑选出具有重组体挑选出具有重组体DNADNA的细胞的细胞克隆克隆DNADNA重组体的构建和克隆重组体的构建和克隆1 1DNADNA片段的直接提取片段的直接提取2 2用噬菌体或质粒从宿主细胞用噬菌体或质粒从宿主细胞中将目的基因携出中将目的基因携出3 3运用相应的运用相应的mRNAmRNA分别基因分别基因1 1粘性末端衔接粘性末端衔接2 2平头末端衔接平头末端衔接3 3在在DNADNA片断末端加上均聚寡核苷酸后片断末端加上均聚寡核苷酸后衔接，在衔接，在3 3-OH-OH端由末端核苷酸转移酶添加单端由末端核苷酸转移酶添加单核苷酸的反响核苷酸的反响4 4用接头衔接：适用于粘端与平端用接头衔接：适用于粘端与平端DNADNA之间的衔接之间的衔接外源外源DNADNA与载体的与载体的DNADNA之间的衔接方式：之间的衔接方式：1 1粘性末端衔接粘性末端衔接TGCATGCAACGTGCATE.coliE.coli质粒质粒限制酶限制酶TGCAACGTTGCAACGT限制酶限制酶ACGTGCATGCAT混合、退火混合、退火 DNADNA衔接酶衔接衔接酶衔接重组体重组体DNADN