专题三：成体干细胞(前言和间充质干细胞)

1、wPpt制作 主题鲜明，重点突出，图文一致 每张内容不宜过多w汇报语言仪态 方式丰富，交流互动讨论课总结成体干细胞adult stem cell w 在个体的发育过程： 成体干细胞的概念 存在于成年个体的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力，已经分化组织中的未分化细胞，能够自我更新并在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。 成体干细胞的特性w （1）极少量，特定区域w （2）通常处于静息状态，分裂缓慢 w （3）自我更新与分化需要特定的微环境 优点分析w 获取相对容易 w 自体成体干细胞避

2、免了移植排斥 w 理论上，成体干细胞致瘤风险很低w 伦理学争议较少 检测方法 w 科学家尚未就成体干细胞的鉴定标准达成一致。w 经常被采用的鉴定方法包括：1)体内示踪法w 2)体外诱导分化 移植的方法u 通过静脉注射移植。u 通过椎管注射移植。u 通过介入方法直接移植到病变部位动脉血管。常见成体干细胞间充质干细胞造血干细胞神经干细胞角膜缘干细胞胰腺干细胞皮肤干细胞肠上皮干细胞 肝脏干细胞间充质干细胞 mesenchymal stem cell u 来源于发育早期的中胚层和外胚层。u MSC最初在骨髓中发现。u 具有多向分化潜能，理想的种子细胞。间充质干细胞生物学特性u 形态特征形态特征u 细胞

3、表面标志细胞表面标志 光学显微镜光学显微镜扫描电镜扫描电镜图图1-8 1-8 核质比高，细胞器少的核质比高，细胞器少的细胞细胞 25 00025 000图图1-9 1-9 核质比较低，细胞器丰核质比较低，细胞器丰富的细胞富的细胞 25 00025 000透射电镜透射电镜公认的骨髓MSCs表面标记： A:不表达分化相关的细胞标志如脂多糖受体CD34以及白细胞表面抗原CD45等。 B:但表达CD44 、 CD54、 CD133 、CD105、 CD90等。间充质干细胞分离培养采集部位采集部位：髂骨上嵴、胫骨和股骨、胸骨和腰椎。分离方法：分离方法：u细胞帖壁筛选法细胞帖壁筛选法 u密度梯度离心法密度

4、梯度离心法 u细胞分子标记分选法细胞分子标记分选法 u细胞筛筛选法细胞筛筛选法图图1 第三代第三代hBMMSCs HE染色染色 1000图图2 hBMMSCs P1,P3,P5代生长曲线代生长曲线 图图3 hBMSCs成骨诱导第成骨诱导第10天倒置天倒置 相差显微镜相差显微镜 400图图7 hBMSCs诱导后碱性磷酸酶染色诱导后碱性磷酸酶染色 400图图4 第第3代代 hBMSCs CD29表达阳性表达阳性200图图5 第第3代代 hBMSCs CD90表达阳性表达阳性200图图6 第第3代代 hBMSCs CD166表达阳性表达阳性200间充质干细胞诱导分化诱导分化成骨细胞 在MSCs培养体

5、系中加入地塞米松、地塞米松、-磷酸甘油和抗坏血酸磷酸甘油和抗坏血酸等单独或联合诱导,发现培养的MSCs逐渐形成聚集体或结节,碱性磷酸酶活性也随之增高,基质钙化明显,可分化为成骨细胞。 透明质酸、骨形态形成蛋白-2 (BMP-2) 以及铜等均可促使MSCs 向成骨细胞分化。 诱导分化软骨细胞（1 1）三维培养方式）三维培养方式（2 2）无血清培养基）无血清培养基（3 3）添加转让生长因子）添加转让生长因子家族成员家族成员 在成人骨髓的MSCs培养体系中加入地塞米松和TGF-3,在第14天时,在细胞外基质中检测到型胶原；在含10 - 7moL/ L 地塞米松的培养基中培养, 有、型胶原表达。 诱导

6、分化脂肪细胞 用异丁基异丁基- -甲基黄嘌呤甲基黄嘌呤 （IBMXIBMX）、地塞米松、胰岛素和）、地塞米松、胰岛素和吲哚吲哚美辛美辛 （IMIM）联合诱导人的MSCs ,可观察到细胞内逐渐聚集含脂质丰富的小泡, 多种诱导处理可使95%以上的细胞定向分化为脂肪细胞,并且细胞内的脂质小泡不断地长大、融合,最终充满细胞。这些分化的脂肪细胞在体外培养可健康生长至少3个月。诱导分化心肌细胞 1 体外分化实验 小鼠股骨中获得骨髓MSCs,经5 5氮氮胞苷胞苷处理,大约30%的MSCs 出现形态学改变,分化为类心肌细胞,并可重复检测到自主起搏细胞。 （视频）（视频）w (1) 分化的MSCs表达出特异性的

7、心房利钠肽利钠肽(ANP)(ANP)和脑利钠肽和脑利钠肽(BNP)(BNP)基因基因。表明分化的细胞含有类心肌收缩蛋白,完全不同于平滑肌细胞及骨骼肌细胞；w (2) 电镜检查电镜检查类心肌细胞的超微结构时可观察到:特征性的经闰盘连接的肌节、中心核和心房颗粒；w (3) 5氮胞苷处理25周后，分化的分化的MSCsMSCs电生理检测到至少有电生理检测到至少有2 2 种完全不同的动作电位种完全不同的动作电位： 2 体内分化w 由MSCs向类心肌细胞分化过程中,除5氮胞苷外,体内心脏微环境对MSCs的分化也至关重要。Wang等在其实验中提及心肌微环境可以支持MSCs移植后的生长和向心肌细胞分化。w “

8、环境依赖性分化”（milieu-dependent differentiation）内容：认为生长因子、细胞因子、细胞外基质等以及它们在干细胞/宿主细胞之间的相互作用，在诱导MSCs向心肌分化方面起着重要作用。 w 尽管MSCs向心肌分化的具体机制不清楚，但一致倾向认为:组织损伤和高水平的多能细胞是其分化的两个重要的决定因素。诱导分化神经细胞w 在丁化羟基苯甲醚丁化羟基苯甲醚(BHA)(BHA)或或-巯基乙醇巯基乙醇作用下, 可诱导大鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化w 用双丁酰环磷腺苷(dbcAMP)和异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)处理MSCs可诱导神经分化早期标记的表达w 在神经生长培养基中添加E

9、GF和脑源性神经营养因子（BDNF）同样可诱导神经分化早期标记的表达。w 在bFGF和PDGF存在下，DMSO/BHA可诱导大鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化。诱导分化内皮细胞w血管内皮生长因子血管内皮生长因子(VEGF)(VEGF) 多能成体祖细胞(multipotentadult progenitor cells,MAPCs)是骨髓MSCs 的一个亚群。2002 年,首次在体外用血管内皮生长因子(VEGF)把人骨髓MSCs 诱导分化成具有脉管母细胞表型的细胞, 随后这些细胞分化成表达内皮细胞标记物的细胞。在培养过程中MAPCs可以不断扩增80多个群体,倍增时间没有明显衰退表现,所以在临床治疗方

10、面,MAPCs是一种理想的内皮细胞来源。w牛垂体内皮细胞生长添加剂牛垂体内皮细胞生长添加剂(endothelial cell growth supplement from bovine pituitary,ECGS) 国内学者用牛垂体内皮细胞生长添加剂(endothelial cell growth supplement from bovine pituitary,ECGS)对兔MSCs进行定向诱导分化，细胞80%融合时呈现“铺路石”样形态,细胞免疫组化证实扩增细胞表达CD31和von Willebrand factor(vWF),具有吞噬ac-LDL的功能,且扩增细胞在体外参与网状血管样结构

11、形成。因此认为,在体外能诱导MSCs向内皮细胞分化。w此外，在创面微环境下在创面微环境下,MSCs可分化为血管内皮细胞,并参与创面修复。诱导分化胰岛细胞w 先用bFGF,EGFbFGF,EGF等因子诱导成人MSCs向nestin阳性的祖细胞(NIP)分化；w 再用高糖无血清培养基和细胞调节素、尼克酰胺等诱导NIP向胰岛样细胞分化 w 结果表明MSC经第一阶段的诱导后可分化成NIP,继续诱导6天后变圆的细胞逐渐增多，并聚集成团，双硫腙染色阳性，免疫组化实验证明经两阶段诱导后的细胞表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等内分泌激素，放免分析结果表明，诱导的胰岛样的细胞团可分泌胰岛素，糖反应性较弱存在以下

12、问题w 随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；w 制备过程不容易质控；w 移植给异体可能引起免疫反应；w 取材时对患者有损伤，患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。干细胞可塑性质疑w 自然界真的存在成年组织干细胞的“可塑性”？w 成体干细胞“可塑性”是实验设计不严谨上的失误抑或一种主观判断错误所致？w 成体干细胞的“可塑性”与全能干细胞或胚胎干细胞又有何关联？w 这些质疑的实质就是：所谓的成体干细胞的“可塑性”缺乏科学依据；成体干细胞的“横向分化”是成年组织中余存的胚胎原始干细胞所为，抑或与自发融合相关。神经干细胞侧脑室下层侧脑室下层海马齿状回海马齿状回神经干细胞特性w 形态特征形态特征 w 表面标志