第1部分专题2课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、第第1部部分分专专题题2课课题题2理解教材理解教材新知新知把握热点把握热点考向考向应用创新应用创新演练演练知识点一知识点一知识点二知识点二考向一考向一考向二考向二返回返回返回返回返回返回返回返回 1.测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平 板法和显微镜直接计数法。板法和显微镜直接计数法。 2稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目，稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目， 但统计结果往往比活菌数目低。但统计结果往往比活菌数目低。3只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作唯一氮源的选择培养基分离该细菌。唯一氮源的

2、选择培养基分离该细菌。4鉴定分解尿素细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基鉴定分解尿素细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，据是否变红进行判断。中加入酚红指示剂，据是否变红进行判断。 返回返回返回返回 自读教材自读教材夯基础夯基础 1筛选菌株的思路筛选菌株的思路 (1)自然界中目的菌株的筛选：自然界中目的菌株的筛选： 依据：根据它对依据：根据它对 的要求，到相应的环境的要求，到相应的环境中去寻找。中去寻找。 实例：实例：PCR技术过程中用到的耐高温的技术过程中用到的耐高温的 ，就是从热泉中筛选出来的，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。细菌中提取出来的。生存环境生存

3、环境Taq DNA聚聚合酶合酶返回返回 (2)实验室中目的菌株的筛选：实验室中目的菌株的筛选： 原理：人为提供有利于原理：人为提供有利于 生长的条件生长的条件(包括包括营养、温度、营养、温度、pH等等)，同时，同时 其他微生物的生长。其他微生物的生长。 方法：利用选择培养基分离。方法：利用选择培养基分离。 a选择培养基：允许选择培养基：允许 微生物生长，同时微生物生长，同时 其他种类微生物生长的培养基。其他种类微生物生长的培养基。 b实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以 作作为唯一氮源，只有能合成为唯一氮源，只有能合成 的微生物才能分解尿素。的微生物才能分解

4、尿素。目的菌株目的菌株抑制或阻止抑制或阻止特定特定阻止阻止或抑制或抑制尿素尿素脲酶脲酶返回返回稀释涂布平板稀释涂布平板稀释度稀释度活菌活菌返回返回 计数原则：一般选择菌落数在计数原则：一般选择菌落数在 的平板进的平板进行计数。行计数。 结果分析：统计的菌落数往往比活菌的实际数目结果分析：统计的菌落数往往比活菌的实际数目 。原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是是 。 (2)其他方法：利用其他方法：利用 直接计数。直接计数。30300低低一个菌落一个菌落显微镜显微镜返回返回 圆褐固氮菌生活于土壤中，能以氮气作为氮源。请探圆褐固氮菌生

5、活于土壤中，能以氮气作为氮源。请探讨、交流实验室分离圆褐固氮菌的方法。讨、交流实验室分离圆褐固氮菌的方法。 提示：提示：配制无氮培养基作为选择培养基。配制无氮培养基作为选择培养基。返回返回 跟随名师跟随名师解疑难解疑难 1选择培养基的类型及作用选择培养基的类型及作用 (1)在培养基中加入某种化学物质。如加入青霉素可以在培养基中加入某种化学物质。如加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可得到金黄色葡分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。这里的加入指的是在培养基的培养成分的基础上萄球菌。这里的加入指的是在培养基的培养成分的基础上加入。加入。 (2)改变培养基中的营养

6、成分。如培养基中缺乏氮源时，改变培养基中的营养成分。如培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也上生存。当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。具有分离效果。 (3)改变微生物的培养条件。如将培养基放在高温环境改变微生物的培养条件。如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。中培养只能得到耐高温的微生物。返回返回 2统计菌落数目统计菌落数目 (1)稀释涂布平板法：稀释涂布平板法： 原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长原理：当样品的稀释度

7、足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进的平板进行计数。行计数。 注意事项：注意事项： a设置重复组：同一稀释度下，至少涂布设置重复组：同一稀释度下，至少涂布3个平板作个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。分析结果时，为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。分析结果时，需考虑重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作

8、需考虑重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。有误，需要重新实验。返回返回 特别提醒特别提醒教材中的实例说明了设置重复组的重要教材中的实例说明了设置重复组的重要性。第一位同学只涂布了性。第一位同学只涂布了1个平板，没有设置重复组，因个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了题，涂布了3个平板，但是，其中个平板，但是，其中1个平板的计数值结果与个平板的计数值结果与另另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将此，

9、不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。个平板的计数值用来求平均值。返回返回 b设置对照：目的是排除实验中非测试因素对实验设置对照：目的是排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验的可信度。结果的影响，提高实验的可信度。 计算公式：每克样品中的菌株数计算公式：每克样品中的菌株数(CV)M。 C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。 V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积。：代表涂布平板时所用的稀释液的体积。 M：代表稀释倍数。：代表稀释倍数。返回返回 (2)显微镜直接计数法：显微镜直接计数法： 原理：此法利用特定细菌计数板或血球计数板，在原理：

10、此法利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。 缺点：不能区分细菌的死活。缺点：不能区分细菌的死活。 方法：用计数板计数。计数板是一块特制的载玻片，方法：用计数板计数。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积为上面有一个特定的面积为1 mm2和高为和高为0.1 mm的计数室，的计数室，在在1 mm2的面积里又被划分成的面积里又被划分成25个个(或或16个个)中格，每个中中格，每个中格进一步划分成格进一步划分成16个个(或或25个个)小格，但计数室都是由小格，但计数室都是由400个个小格组成的。如图所示。小格组成的

11、。如图所示。返回返回 计算公式：每毫升原液所含细菌数每小格平均计算公式：每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数细菌数40010 000稀释倍数。稀释倍数。返回返回 自读教材自读教材夯基础夯基础 有机质有机质中性中性38 cm返回返回30300温度温度时间时间数目稳定数目稳定返回返回 (4)计数：当菌落数目稳定时，取同一计数：当菌落数目稳定时，取同一 下的下的3个平个平板进行计数，求出板进行计数，求出 ，并根据所对应的，并根据所对应的 计算出计算出样品中细菌的数目样品中细菌的数目稀释度稀释度平均值平均值稀释度稀释度返回返回 2菌种鉴定菌种鉴定 (1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为原理：

12、分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为 ，使培养基的使培养基的 增强。增强。 (2)方法：在以方法：在以 为唯一氮源的培养基中加入为唯一氮源的培养基中加入 指示指示剂培养细菌，若指示剂变剂培养细菌，若指示剂变 ，可确定该种细菌能够分解尿，可确定该种细菌能够分解尿素。素。氨氨碱性碱性尿素尿素酚红酚红红红返回返回 1当第一次测定时为什么要将稀释的范围放宽一些？当第一次测定时为什么要将稀释的范围放宽一些？ 提示：提示：为确保能从中选择出菌落数在为确保能从中选择出菌落数在30300之间的之间的平板进行计数。平板进行计数。 2为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结

13、果？ 提示：提示：防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。返回返回 跟随名师跟随名师解疑难解疑难 1操作中的注意事项操作中的注意事项 (1)无菌操作：铁铲和信封都要灭菌。称取土壤、将称无菌操作：铁铲和信封都要灭菌。称取土壤、将称好的土样倒入锥形瓶、稀释土壤溶液，每一步都要在酒精好的土样倒入锥形瓶、稀释土壤溶液，每一步都要在酒精灯的火焰旁进行。灯的火焰旁进行。 (2)做好标记：如在培养皿上注明培养基种类、培养日做好标记：如在培养皿上注明培养基种类、培养日期以及培养样品的稀释度等。期以及培养样品的稀释度等。 返回返回 2结果分析与评价结果分析与评价 (1)培

14、养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落：对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养菌落：对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。 (2)样品的稀释操作是否成功：如果得到了样品的稀释操作是否成功：如果得到了2个或个或2个以上个以上菌落数目在菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌

15、落的计数。够进行菌落的计数。 (3)重复组的结果是否一致：如果不同同学选取的是同一重复组的结果是否一致：如果不同同学选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要分种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要分析产生差异的原因。析产生差异的原因。返回返回返回返回 例例1 下表是培养分解尿素的细菌的培养基配方，请下表是培养分解尿素的细菌的培养基配方，请回答下面的问题：回答下面的问题：编号编号成分成分含量含量KH2PO41.4 g Na2HPO42.1 g MgSO47H2O0.2 g 葡萄糖葡萄糖10.0 g 尿素尿素1.0 g 琼脂琼脂15.0 g 将上述物质溶解后，用自

16、来水定容到将上述物质溶解后，用自来水定容到1 000 mL返回返回 (1)在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的是在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的是_，提供氮源的是，提供氮源的是_。 (2)绝大多数微生物都能利用绝大多数微生物都能利用_，但是，只有，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解能合成脲酶的微生物才能分解_。 (3)分析该培养基的配方，该培养基对微生物是否具分析该培养基的配方，该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？ 返回返回 解析解析碳源是提供碳元素的物质，氮源是提供氮元碳源是提供碳元素的物质，氮源是提供氮元素的物

17、质，所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。该培养基的素的物质，所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。该培养基的配方中含有凝固剂配方中含有凝固剂琼脂，所以，配制的一定为固体培琼脂，所以，配制的一定为固体培养基。绝大多数生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成养基。绝大多数生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以这种培养基对微生物有脲酶的微生物才能分解尿素，所以这种培养基对微生物有选择作用。选择的原理是只有能够利用尿素的微生物才能选择作用。选择的原理是只有能够利用尿素的微生物才能够生长。够生长。 答案答案(1)葡萄糖尿素葡萄糖尿素 (2)葡萄糖尿素葡萄糖尿素 (3)该培养基对微生物具有选择作

18、用。以尿素为唯一氮该培养基对微生物具有选择作用。以尿素为唯一氮源的培养基可以分离得到产生脲酶的微生物源的培养基可以分离得到产生脲酶的微生物(即分解尿素的即分解尿素的微生物微生物)。返回返回 (1)病毒为非细胞结构生物体，专营活细胞内寄生生活，病毒为非细胞结构生物体，专营活细胞内寄生生活，目前不能利用人工培养基来培养。目前不能利用人工培养基来培养。 (2)能够在选择培养基上生长的微生物不一定是实验所需能够在选择培养基上生长的微生物不一定是实验所需要的微生物，因为有些微生物可利用其他微生物的代谢产物要的微生物，因为有些微生物可利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖，因此还需要对分离后的微生物进行鉴定

19、。进行生长繁殖，因此还需要对分离后的微生物进行鉴定。返回返回 例例2 自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。 实验步骤：实验步骤： (1)制备稀释倍数为制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。的系列稀释液。 (2)选用选用_法接种样品。法接种样品。 (3)适宜温度下培养。适宜温度下培养。返回返回 结果分析：结果分析：

20、(1)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是 () A一个平板，统计的菌落数是一个平板，统计的菌落数是23 B两个平板，统计的菌落数分别是两个平板，统计的菌落数分别是22和和26，取平均，取平均值值24 C三个平板，统计的菌落数分别是三个平板，统计的菌落数分别是21、5和和52，取平，取平均值均值26 D四个平板，统计的菌落数分别是四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和和25，取平均值取平均值25返回返回 (2)一同学在稀释倍数为一同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板上菌落的培养基中测得平板上菌落数的平均值为数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌株数是，那么每毫升样品中的菌株数是(涂布平涂布平板时所用稀释液的体积为板时所用稀释液的体积为0.2 mL)_。 (3)用这种方