血红蛋白的提取和分离

1、血红蛋白含有四条肽链血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，每个基团可携带每个基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因血红蛋白因含有含有血红素血红素而呈而呈红色。红色。课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离一、基础知识一、基础知识: :预习提纲：预习提纲：1.1.不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异？蛋白质不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异？蛋白质的提取和分离的方法有哪些？的提取和分离的方法有哪些？2.2.凝胶色谱法分离蛋白质的原理是什么？凝胶色谱法分离蛋白质的原理是什么？4.4.什么事缓冲液？它的作

2、用是什么？什么事缓冲液？它的作用是什么？3.3.凝胶电泳法分离蛋白质的原理是什么？凝胶电泳法分离蛋白质的原理是什么？一、一、蛋白质提取和分离原理蛋白质提取和分离原理 蛋白质的物理化学性质：蛋白质的物理化学性质：形状、大小、电荷性质和多少形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。亲和力等千差万别。 提取提取分离分离方法方法凝胶色谱法凝胶色谱法 (凝胶凝胶)电泳法电泳法 (一一)凝胶色谱法凝胶色谱法（1 1）原理）原理大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。小分

3、子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。（2 2）分离过程（简述）分离过程（简述） 混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 (一一)凝胶色谱法凝胶色谱法1.1.原理：原理： 不同蛋白质的不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小带电性质、电量、形状和大小 不同不同，导致不同蛋白质在电场中的，导致不同蛋白质在电场中的运动方向运动方向 和运动速度不同和运动速度不同。 ( (三三) )电泳电泳-凝胶电泳法凝胶电泳法二、实验操作二、实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1 1）样品处

4、理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作收集到的血红蛋白溶液。离心分离等操作收集到的血红蛋白溶液。（2 2）粗分离：）粗分离：透析透析除去分子较小的杂质。除去分子较小的杂质。（3 3）纯化：通过）纯化：通过凝胶色谱法凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋将分子量较大的杂质蛋白质除去。白质除去。（4 4）纯度鉴定纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳鉴定。鉴定。1.1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞阅读思考：洗涤的目的是什么？阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤过程：洗涤过程：血液血液100mL100mL3g3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速离心低速离

5、心2 min2 min红细胞红细胞血血 浆浆吸出血浆吸出血浆红细胞红细胞5倍体积生理盐水倍体积生理盐水搅拌搅拌10min重复洗涤重复洗涤3 3次，直至上清液没有黄色次，直至上清液没有黄色初次离心后的结果初次离心后的结果3次洗涤后的结果返回返回2.2.释放血红蛋白释放血红蛋白阅读思考：阅读思考：1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？哪些物质？2. 为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：目的分析：蒸馏水的作用是蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_

6、。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂3.3.分离血红蛋白分离血红蛋白分离过程分离过程红细胞红细胞混合液混合液高速离心高速离心10min 离心离心管管滤纸滤纸过滤过滤脂类物质脂类物质烧杯烧杯4.4.透析血红蛋白透析血红蛋白20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液1mL1mL利用透析袋透析利用透析袋透析透析过程透析过程纯化凝胶色谱操作纯化凝胶色谱操作1.1.凝胶色谱柱的凝胶色谱柱的制作制作：2.2.凝胶色谱柱的凝胶色谱柱的装填装填：教材图教材图5193.3.样品的样品的加入和洗脱加入和洗脱装配好的凝胶柱1.1.分离血红蛋白时，选

7、择鸡血细胞还是猪血细胞好？分离血红蛋白时，选择鸡血细胞还是猪血细胞好？为什么？若是提取为什么？若是提取DNADNA呢？呢？2.2.与真核细胞其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特与真核细胞其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点，这一特点对分离有什么意义？点，这一特点对分离有什么意义？ 1.猪血好，因为哺乳动物成熟红细胞无细胞核，血红猪血好，因为哺乳动物成熟红细胞无细胞核，血红蛋白含量高蛋白含量高2.选鸡血，因为哺乳动物成熟红细胞无细胞核，选鸡血，因为哺乳动物成熟红细胞无细胞核，DNA含量低含量低思考与讨论思考与讨论血红蛋白时有色蛋白，在凝胶色谱分离是可以通过血红蛋白时有色蛋白，在凝胶色谱分离是可以通过观

8、察颜色来判断什么时候收集洗脱液。观察颜色来判断什么时候收集洗脱液。知识总结知识总结血血红红蛋蛋白白的的提提取取和和分分离离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法凝胶色谱法原原 理理分离过程分离过程凝胶电泳法凝胶电泳法缓冲溶液缓冲溶液组组 成成作作 用用蛋白质的蛋白质的提取分离提取分离样品处理样品处理粗粗 分分 离离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定教学反馈教学反馈 1凝胶色谱法是根据（凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。）分离蛋白质的有效方法。 A分子的大小分子的大小 B相对分子质量的大小相对分子质量的大小 C带电荷的多少带电荷的多少 D溶解度溶解度2缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制

9、外界的影响来缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（维持（ ）基本不变。）基本不变。 A温度温度 B pH C渗透压渗透压 D氧气浓度氧气浓度3电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。）的电极移动。 A相同相同 B相反相反 C相对相对 D相向相向4. 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的）与氧气的运输有关。运输有关。 A血红蛋白血红蛋白 B肌红蛋白肌红蛋白 C肌动蛋白肌动蛋白 D肌球蛋白肌球蛋白BBBA5 5血液由血浆和各种血细胞组成，其中（血液由血浆和各种血细胞组成，其中

10、（ ）的含量最多。的含量最多。 A A白细胞白细胞 B B血小板血小板 C C红细胞红细胞 D D淋巴细胞淋巴细胞6 6为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（凝血剂（ ）。）。 A. NaCl B.A. NaCl B.甲苯甲苯 C.C.蒸馏水蒸馏水 D.D.柠檬酸钠柠檬酸钠7 7将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为可以明显看到试管中的溶液分为4 4层，其中第层，其中第3 3层是（层是（ ） A A无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层 B B脂溶性物质的沉淀层脂溶性物质的沉淀层

11、C C血红蛋白的水溶液血红蛋白的水溶液 D D其他杂质的暗红色沉淀物其他杂质的暗红色沉淀物CDC练习巩固练习巩固1 1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是的一步是A A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构B B 弄清各种蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能C C 弄清各种蛋白质的合成过程弄清各种蛋白质的合成过程D D 获得高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质2 2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是关于蛋白质的叙述，正确的是

12、A A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质B B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质C C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质D D 二者根本无法比较二者根本无法比较3 3、使用、使用SDS-SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于白质的电泳迁移率完全取决于A A 电荷的多少电荷的多少 B B 分子的大小分子的大小C C 肽链的多少肽链的多少 D D 分子形状的差异分子形状的差异4 4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A A 调节调节pH B pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能量供应C C 防止微生物生长防止微生物生长 D D 防止血液凝固防止血液凝固5 5、一分子血红蛋白最多可携带的