第十章双水相萃取

1、双水相萃取（aqueous two-phase extraction）是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来实现分离的一新型分离技术。 它具有收率高、成本低、可连续化操作等技术优势，已被广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域，进行生物转化，蛋白质、核酸等产品的分离纯化。 第十章第十章 双水相萃取双水相萃取 用此方法提纯的酶已达数十种，其分离也达到了相当规模。近年来又进行了双水相萃取氨基酸类和病毒小分子物质的研究，大大扩展了应用范畴并提高了选择性，使双水相萃取技术具有更大的潜力和美好的发展前景。 双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与

2、盐之间的不相容性，当聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不互溶的两相。 因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两相中水分都占很大比例(85一95)，活性蛋白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同比例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点。 双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2 25 5倍，倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还是与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相

3、比，无论在收率上还是成本上都要优越得多。成本上都要优越得多。双水相萃取法和传统的分离方法双水相萃取法和传统的分离方法( (如盐析或有机溶剂沉淀等如盐析或有机溶剂沉淀等) )相比相比也有很大的优势，处理量相同时，双水相萃取法比传统的分离方也有很大的优势，处理量相同时，双水相萃取法比传统的分离方法法, ,设备需用量要少设备需用量要少3 31010倍，因此已被广泛地应用在生物化学、倍，因此已被广泛地应用在生物化学、细胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病细胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病毒等产品的分离纯化和分析等。毒等产品的分离纯化和分析等。用此法来提纯的酶已达

4、数十种，其分离过程也达到相当规模，用此法来提纯的酶已达数十种，其分离过程也达到相当规模， 操作条件温和，在常温常压下进行； 两相的界面张力小，一般在10-4Ncm量级，两相易分散， 两相的相比随操作条件而变化； 上下两相密度差小，一般在10 g/L。因此两相分离较困难，目前这方面研究较多 易于连续操作，处理量大，适合工业应用。 是否分层或混合成一相，取决于：是否分层或混合成一相，取决于： 熵增与分子数目有关 分子间作用力与分子大小有关 离子型高聚物非离子型高聚物（分子间斥力） 高聚物相对低分子量化合物（盐析作用） 聚合物的不相溶性聚合物的不相溶性(incompatibility)：当两种高分子

5、聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。 10.210.2双水相的形成及制备双水相的形成及制备 可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。 双水相萃取中常采用的双聚合物

6、系统为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相。 PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，下相富含无机盐。典型的双水相体系 物质类型物质P的名称物质Q的名称两种非离子型聚合物聚丙二醇聚乙二醇 聚乙烯醇葡萄糖（Dex）羟丙基葡萄糖 聚乙二醇（PEG）聚乙烯醇葡萄糖 (Dex)聚乙烯吡咯烷酮P为带电荷聚电解质硫酸葡聚糖钠盐羧甲基葡聚糖钠盐聚丙二醇、聚乙二醇甲基纤维素P Q都为聚电解质 羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基纤维素钠盐P为聚合物Q为盐类 聚乙二醇 磷

7、酸钾、硫酸铵、硫酸钠硫酸镁、酒石酸钾钠图中把均相区与两相区分开的曲线，称为双节点曲线。如果体系总组成位于双节点曲线下方的区域，两高聚物均匀溶于水中而不分相。如果体系总组成位于双节点曲线上方的区域，体系就会形成两相。上相富集了高聚物Q，下相富集了高聚物P。用A点代表体系总组成，B点和C点分别代表互相平衡的上相和下相组成，称为节点。A、B、C三点在一条直线上，称为系线。 a双节线系线b双节线均相区均相区两相区两相区系线临界点 图a和b分别为PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图 在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即 系线的长度是衡量两

8、相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时，即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。10.3双水相中的分配系数及影响分配的因素双水相中的分配系数及影响分配的因素 与溶剂萃取相同，溶质在双水相中的分配系数也用k=c1/c2表示。为简便起见，用c1 和c2分别表示平衡状态下上相和下相中溶质的总浓度。溶质在双水相中的分配受表面自由能、表面电荷、疏水作用及生物亲和作用等因素的影响，其中表面自由能、表面电荷对分配行为的影响最为重要，因而对这两方面的理论研究也比较深入。溶质分配的理

9、论研究对双水相萃取起到指导作用，使萃取过程可通过控制相关的影响因素而得到优化。 影响物质在双水相系统中分配的因素主要有:双水相系统的聚合物组成(包括聚合物类型、平均分子量);盐类(包括离子的类型和浓度、离子强度、pH值);溶质的物理化学性质(包括分子量、等电点);体系的温度等; 这些参数并不是独立地起作用。要预测溶质在双水相系统间的分配系数是困难的。 这些系统复杂性表现在如下的一些例子中：在一相中引入疏水性基团会影响离子的分配和电位，在大分子(亲水聚合物或蛋白质溶质)结构中构象的变化，能使另一些原子暴露在微环境中。这些事实导致只能用实验的方法来确定满足分配要求的操作条件。 双水相中聚合物组成的

10、影响双水相中聚合物组成的影响 双水相系统作为一种成功的萃取方法，很大程度上取决于使用的聚合物类型。当两种不同聚合物的溶液混合时，可能存在三种情况：a 完全混溶性(匀相溶液)；b 物理的不相溶性(相分离)；c 复杂的凝聚(相分离,聚合物聚集在同一相中，纯溶剂-水聚集在另一相中)。离子和非离子聚合物都可以使用在双水相系统的构成上，但是，当这两种聚合物是离子化合物并带有相反电荷时，它们互相吸引并发生复杂的凝聚。 双水相系统物理化学性质的影响双水相系统物理化学性质的影响 双水相系统的性质主要取决于下列物理化学参数：双水相系统的性质主要取决于下列物理化学参数：密度密度( () )和两相间的密度差，和两相

11、间的密度差，黏度黏度( () )和两相间的黏度差以及表面张力和两相间的黏度差以及表面张力( () )。盐和缓冲液的影响盐和缓冲液的影响盐的种类和浓度对分配系数的影响主要反映在对相间电位和蛋白质疏水性的影响。在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数，不同电解质的正负离子的分配系数个同，当双水相系统中含有这些电解质时，由于两相均应各自保持电中性，从而产生不同的相间电位，因此，盐的种类(离子组成)影响蛋白质、核酸等生物大分子的分配系数。盐浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比。 如，PEG/KPi系统中上、下相(或称轻重相)的PEG和磷酸钾浓度以及

12、Cl离子在上、下相中的分配平衡随添加NaCl浓度的增大而改变。 这种相组成即相性质的改变直接影响蛋白质的分配系数。 离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这一特点，通过调节双水相系统中的盐浓度，可有效地萃取分离不同的蛋白质。11.3.4 温度的影响温度的影响温度影响双水相系统的相图，温度影响双水相系统的相图，因而影响蛋白质的分配系数。因而影响蛋白质的分配系数。但一般来说，当双水相系统离但一般来说，当双水相系统离双节线足够远时，温度的影响双节线足够远时，温度的影响很小，很小，1-2度的温度改变不影响度的温度改变不影响目标产物的萃取分离。目标产物的萃取分离。大规模双水相萃取操作一般在大规模双水相

13、萃取操作一般在室温下进行，不需冷却。这是室温下进行，不需冷却。这是基于以下原因：基于以下原因：(1)成相聚合物成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常对蛋白质有稳定作用，常温下蛋白质一般不会发生失活温下蛋白质一般不会发生失活或变性；或变性；(2)常温下溶液粘度较常温下溶液粘度较低，容易相分离；低，容易相分离；(3)常温操作常温操作节省冷却费用。节省冷却费用。双水相系统的应用双水相系统的应用 双水相萃取自发现以来，无论在理论上还是实践双水相萃取自发现以来，无论在理论上还是实践上都有很大的发展。在最近几年中更为突出上都有很大的发展。在最近几年中更为突出, ,在若干在若干生物工艺过程中得到了应用，其中最重要的领域是蛋生物工艺过程中得到了应用，其中最重要的领域是蛋白质的分离和纯化。白质的分离和纯化。 (1) 产品的浓缩 （2）蛋白质的提取和纯化 （3）生物小分子的分离和纯化 （4） 中草药有效成分的提取 （5）生物活性物质的分析检测 大作业(8选5,有关膜分离的最少必选一题)1，微滤(MF)、超滤（UF）、纳滤（NF）、反渗透（RO）、都是以压力差为推动力的膜分离过程，