基因工程2015

1、基因工程实验讲义指导教师 林陈水浙江工业大学药学院2015年11月目 录实验一、质粒DNA的碱裂解法提取与纯化实验二、DNA分子的限制性内切酶消化实验三、聚合酶链式反应(PCR)扩增目的DNA实验四、大肠杆菌感受态细胞制备及质粒DNA转化实验五、重组外源基因在大肠杆菌中的诱导表达实验六、表达蛋白的SDS-PAGE分析实验一、质粒DNA的碱裂解法提取与纯化一、实验目的与内容1、细菌培养及菌体的收集、裂解。2、碱裂解法提取质粒DNA。二、实验原理 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下

2、可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，其重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共

3、价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 目前大部分实验室采用柱层析法纯化质粒DNA。操作步骤及注意事项详见试剂盒产品说明书。三、试剂准备1溶液：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5

4、mL，0.5M EDTA(pH 8.0)10 mL，葡萄糖4.730 g，加ddH2O至500 mL。在10 lbf/in2高压灭菌15 min ，贮存于4。2溶液：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1 mL，10%SDS 1 mL，加ddH2O至10 mL。使用前临时配置。3溶液：醋酸钾(KAc)缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300 mL，冰醋酸 57.5 mL，加ddH2O至500 mL。4保存备用。4TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)1 mL，0.5M EDTA(pH 8.0)0

5、.2 mL，加ddH2O至100 mL。高压湿热灭菌30 min，4保存备用。5苯酚(Tris-HCl(pH 8.0)平衡)、氯仿/异戊醇(24：1)6乙醇(无水乙醇、70%乙醇)710×TAE缓冲液(pH8.0)：Tris 48.48 g，冰乙酸11.42 mL，EDTA3.72 g，定容至1000 mL。8溴化乙锭(EB)：10m g/ mL。本实验采用新型无致癌性的DNA染料代替。9RNase A(RNA酶A)：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10m g/ mL，TE配制，沸水加热15 min，分装后贮存于-20。106×loading buff

6、er(上样缓冲液)：0.25%溴酚蓝，40%(m/V)蔗糖水溶液。110.8%琼脂糖凝胶：称取1.2 g琼脂糖于三角烧瓶中，加150 mL 0.5×TAE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60左右(不烫手)，加EB母液(10 mg/mL)至终浓度0.5 ug/mL(注意：EB为强诱变剂，操作时带手套)，轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30 min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中(电泳缓冲液0.5×TAE)，即可上样。四、操作步骤1挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于3 mL LB(含相应抗生素)液体培养基中，37、200rpm振荡培养过夜(约12

7、-14hr)。2取1.2 mL培养物入离心管中，室温离心10000 g×0.5 min，弃上清，将离心管倒置，用真空泵将上清液小心吸尽。3将细菌沉淀重悬于100 µL预冷的溶液中，涡旋振荡，使菌体分散混匀。4加200 µL新鲜配制的溶液，温柔颠倒68次混匀(切勿剧烈振荡)，使细胞膜裂解，冰浴35 min(溶液为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清)。5加入150 µL预冷的溶液，将管温和颠倒68次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5 min(放置时间不可过长，为什么？)。溶液为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K

8、+使SDS-蛋白复合物沉淀。64离心12000 g×5 min，小心移出上清于一新微量离心管中，加入200 µL的苯酚和200 µL氯仿/异戊醇，振荡1 min混匀。74离心12000 g×5 min，小心移出上清于一新微量离心管中，加入400 µL氯仿/异戊醇，振荡混匀。84离心12000 g×5 min，小心移出上清于一新微量离心管中(吸上清时注意估算体积)，加入2倍体积无水乙醇(为什么?)，混匀，室温放置2-5 min。94离心12000 g×10 min，弃上清，1 mL预冷的70%乙醇洗涤沉淀12次，4离心1200

9、0 g×10 min，弃上清，将沉淀用滤纸或真空吸干。10沉淀溶于30 µL TE或水(含RNase A 20u g/ mL)，37水浴30 min以降解RNA分子，-20保存备用。五、质粒DNA的电泳检测观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的

10、590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。取制备的质粒DNA 510 µL，加1/5体积的6×Loading Buffer混匀上样，采用15V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动至合适位置，取出凝胶置紫外灯下检测，摄片。六、注意事项本裂解法小量制备质粒DNA重复性好一般不影响进一步实验操作。若所提取质粒DNA不能被限制性内切酶切割，可通过酚/氯仿再次抽提，以清除杂质来解决问题。七、讨论1加入溶液后，为什么不能剧烈振荡？2为什么质粒DNA电泳呈现多条带？实验二、DNA分子的限制性内切酶消化及电泳鉴定一、实验目的1掌握限制性内切酶

11、的作用。2学习琼脂糖凝胶电泳的方法。二、实验原理限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端(即粘端)的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50 µL体积1小时内完全切开1 ug噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是

12、，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液(Buffer，10×、5×)和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。三、实验准备1待消化的DNA片段：实验一制备得到的DNA2限制性内切酶及其缓冲液3琼脂糖4溴化乙锭EB(10m g/ mL贮藏液)510×TAE缓冲液(pH8.0)：Tris 48.48 g，冰乙酸11.42 mL，EDTA3.72 g，定容至1000 mL。6加样缓冲液：0.25%溴酚蓝， 40%(m/V)蔗糖水溶液，4保存。四、操作步骤(一)、质粒DNA的酶解1将实验一纯

13、化的并经过RNase A消化的质粒DNA作为DNA样品。2将清洁、干净、灭菌的Ep管编号，用微量加样器按表所示将各种试剂分别加入每个Ep管内。加样表：样品DNA µL限制性内切酶A µL限制性内切酶B µL10×Buffer µLddH2O µL总体积 µL3加样后，稍加离心混匀，置于37水浴中，酶解23h(必要时可以延长或过夜)。(二)、琼脂糖凝胶板的制备1琼脂糖凝胶的制备：准确称取琼脂糖，置于锥形瓶中，加入TAE稀释液。微波加热直至溶液清凉，冷却至60(不烫手)，加入溴化乙锭。高浓度2.5低浓度0.8琼脂糖1.25 g1

14、.20 g0.5×TAE50 mL150 mLDNA染料5 µL15 µL2胶板的制备：取有机玻璃内槽，洗净、晾干。用宽胶布将有机玻璃内槽的两端边缘封好，将有机玻璃内槽置于一水平位置，放好样品模板(梳子)。3将冷却至60左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，使整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置，待完全凝固后，轻轻拔出样品槽模板。 (三)、加样在一次性手套上用微量取液器将样品与1/5体积的6×Loadin g Buffer混匀，将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。每槽加样量约1030 µL。(四)、电泳加完样品后的凝胶板应立即通

15、电进行电泳。样品进胶前，应使电流控制在5mA左右，样品进胶后电流为10mA左右(70100V)，当溴酚兰染料移到距离胶板下沿约12cm处停止电泳。(五)、取出电泳后的胶片，在紫外灯下进行观察、摄片，记录电泳结果。五、注意事项1浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。(思考原因？)2购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20冰箱。3尽量减少反应体积，但要

16、确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。4通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。5溴乙锭是强烈的诱变剂，并有中度毒性，使用时应带手套，电泳废弃物专门放置或处理，避免溴乙锭污染实验台，溴乙锭贮存液应避光保存。六、讨论1影响限制性内切酶效率的因素有哪些？2琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子的原理是什么？3样品应放正极还是负极？为什么？实验三、聚合酶链式反应(PCR)扩增目的DNA一、实验目的1学习通过聚合酶链式反应(PCR)在体外大量扩增位于两段已知序列间的双链DNA区段。2掌握PCR仪的一般操作方法和步

17、骤。二、实验原理聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由高温变性模板低温下引物与模板退火适温下引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下(通常为93-94)使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶(Taq酶等)在72将单核苷酸从引物的3端开始掺入，以目的基因为模板从53方

18、向延伸，合成DNA的新互补链。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1)、生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2)、由少量mRNA生成cDNA文库；(3)、从cDNA中克隆某些基因；(4)

19、、生成大量DNA以进行序列测定；(5)、突变的分析；(6)、染色体步移；(7)、RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。三、试剂准备1DNA模版2对应目的基因的特异引物310×PCR Buffer42.5 mM dNTPs：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mM5DNA聚合酶四、操作步骤1在冰浴中，按下表将各成分加入一灭菌的PCR管中，混匀。视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。DNA模板(50 ng-1 ug/ µL) µL引物1(10 µM) µL引物2(10 µM) µLMg2+ µ

20、LdNTP mix( 2.5mM) µL10×PCR Buffer µLDNA polymerase (5 U/µL) µLddH2O µL总体积50 µL 2调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在94预变性35 min，进入循环扩增阶段：94 30 s 30 s 72 s，循环30，最后在72 保温10 min,14保温2 min。3结束反应，PCR产物放置于4待电泳检测或-20长期保存。4PCR的电泳检测：直接取510 µL电泳检测。五、PCR反应体系的组成与反应条件的优化P

21、CR反应体系由反应缓冲液(10×PCR Buffer)、脱氧核苷三磷酸底物(dNTPmix)、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、寡聚核苷酸引物(Primer1，Primer2)、靶序列(DNA模板)五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。1反应缓冲液：一般随Pfu DNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3室温)，1.5mM M gCl2。M g2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200µM时，M g2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯

22、合物，可适当增加M g2+的浓度。在高浓度DNA及dNTPs条件下进行反应时，也必须相应调节M g2+的浓度。据经验，一般以1.52mM(终浓度)较好。2dNTP：高浓度dNTPs易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50400µM的dNTPs。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTPs能与M g2+结合，使游离的M g2+浓度降低。因此，dNTPs的浓度直接影响到反应中起重要作用的M g2+浓度。3 DNA

23、聚合酶：在100 µL反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时(如20 µL或50 µL)，一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。4引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：(1)、引物的长度以15-30bp为宜，一般( G+C

24、)的含量在40-60%，Tm值高于55Tm=4n( G+C)+ 2n(A+T)。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。(2)、引物的3端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。(3)、人工合成的寡聚核苷酸引物需经PA GE或离子交换HPLC进行纯化。(4)、引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体(prim

25、er-dimer)，二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.250.5pM/ µL较好。(5)、引物一般用TE配制成较高浓度的母液(约100µM)，保存于-20。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10µM或20µM的工作液。5模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品(甚至是来自单一细胞的DNA)作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用u g水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以

26、是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。6PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。六、注意事项1PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。 2纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。 3所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。 4PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22µM滤膜过滤除菌或高压灭菌。 5试剂都

27、应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。 6试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。 7PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。七、讨论1步骤2中，为什么第一次变性要35 min？为什么循环结束后要在72下保温10 min？ 2新扩增出的DNA的量与哪个因素关系最大？ 3为什么M g2+对反应的特异性及产量有着显著影响？ 实验四、大肠杆菌感受态细胞制备及质粒DNA转化一、实验目的 1学习感受态细胞的制备。 2学习将外源基因导入细胞的方法。二、实验原理在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合

28、作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-，M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2，RbCl(KC

29、l)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存(半年)，因

30、此CaCl2法为使用更广泛。 本实验以E.coli JF1125菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pET质粒共保温，实现转化。由于pET质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pET，则在含Amp的培养基上不能生长。能在含Amp的培养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了pET。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。三、实验准备1材料：E.coli JF1125菌株；pET质粒DNA(购买或实验室自制)；离心管(EP，eppendorf)。2设备：恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工

31、作台，低温冰箱，恒温水浴锅，分光光度计，微量移液枪。3LB液体培养基：胰化蛋白胨(细菌培养用)10 g，酵母提取物(细菌培养用)5 g，NaCl 10 g，加ddH2O至1000 mL，完全溶解，分装小瓶，湿热高压灭菌2030 min。41.5%琼脂LB固体培养基：称取1.5 g琼脂粉放入300 mL锥形瓶，加100 mL LB，高压灭菌20 min，稍冷却，制备平皿。5抗生素(Amp或Kan)母液：100m g/ mL。6含抗生素的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60左右，加入抗生素母液，使终浓度为100u g/ mL，摇匀后铺板。70.1mol/L CaCl2溶液：称

32、取1.11 g CaCl2(无水，AR)，溶于适量去离子水中，定容至100 mL，高压灭菌。8含15%甘油的0.1mol/L CaCl2：称取1.11 g CaCl2(无水，AR)，溶于适量去离子水中，加入15 mL甘油，定容至100 mL，高压灭菌。四、操作步骤(一)、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E.coli JF1125单菌落，接种于3 mL LB液体培养基(不含抗生素)中，37200rpm振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100 mL LB液体培养基(不含抗生素)中，37，250rpm振荡培养23小时至OD6000.30.5左右(

33、细胞数<108/ mL)。(二)、感受态细胞的制备(CaCl2法)1取1 mL菌液于1.5 mL EP管中，3000 g离心5 min，弃上清(可用加样器将残余液体尽量除去)；重复一次。2用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液360 µL轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟后，4下1600 g离心10分钟。3弃去上清，再加入360 µL预冷的0.05mol/L的CaCl2，重悬细胞，于冰上放置15分钟，4下1600 g离心10分钟，弃上清，200 µL预冷的0.05mol/L的CaCl2，重悬细胞，即制成感受态细胞(可于冰上保存一周)。4或弃去上清，加入200

34、 µL预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，制成感受态细胞悬液，贮存于-70可保存半年。(三)、转化1从-70冰箱中取200 µL感受态细胞悬液，冰浴中解冻。或直接用上述步骤3的感受态细胞悬液。2加入pET质粒DNA溶液2 µL(含量3050n g)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。342水浴中精确热击90秒或37水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却35 min。4向管中加入800 µL LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37振荡培养1hr，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。5将

35、上述菌液于1600 g下，离心10 min，弃去大部分上清液，留下约100 µL，重悬后涂布于含抗生素的筛选平板上，正面向上放置15 min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37培养1624hr。同时做两个对照：对照组1、以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5 µL 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。五、注意事项1实验所用的溶液最好用3次蒸馏的水配制，尽量在冰上操作。2所有与细菌接触的物品和液体都应是无菌的，重

36、悬细胞时操作要轻。六、思考与讨论 1本实验成功的关键是什么？ 2制备感受态细胞及转化外源基因的机理是什么？ 3本实验中，抗生素的作用是什么？实验五、重组外源基因在大肠杆菌中的诱导表达一、实验目的1学习构建重组基因工程菌的方法。2学习重组转化子的筛选及培养转化子细胞并诱导外源基因表达的方法。二、实验原理将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是

37、，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： (1)选择标志的编码序列； (2)可控转录的启动子； (3)转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； (4)一个多限制酶切位点接头； (5)宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下： 获得目的基因准备表达载体将目的基因插入表达载体中(测序验证)转化表达宿主菌诱导靶蛋白的表达表达蛋白的分析扩增、纯化、进一步检测。三、试剂准备1LB培养基。2100mM IPT G(异丙基-巯基

38、-D-半乳糖苷)：2.38 g IPT G溶于100 mL ddH2O中，0.22µM滤膜抽滤，-20保存。四、操作步骤(一)获得目的基因 1通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点)，PCR循环获得所需基因片段。 2通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。(二)构建重组表达载体1载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳后，用胶回收试剂盒或冻融法回收载体大片段

39、。2PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。(三)获得含重组表达质粒的表达菌种1将连接产物转化大肠杆菌JM1125，根据重组载体的标志(Amp抗性或蓝白斑)作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。2测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。3以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。(四)诱导表达1挑取含重组质粒的菌体单斑至3 mL LB(含Amp50u g/ mL)中37 200r/m，过夜培养。2分别将100 µL菌液加入到2-5支含3 mLLB培养基的试管中，3720

40、0rmp震荡培养至OD0.41.0(最好0.6，大约需3hr)。3取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组，两组继续37震荡培养3hr。4分别取菌液1 mL，12000 g，30s收获沉淀，用50-100 µL水重悬菌体，待做SDS-PA GE等分析。五、注意事项1选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。2融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。六、讨论诱导表达的步骤中为什么要在将菌体培养至OD0.41.0？实验六、

41、表达蛋白的SDS-PA GE分析一、实验目的学习应用SDS-PA GE技术检测蛋白质的方法。二、实验原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷、形状和分子量。强阴离子去污剂SDS与还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，并使蛋白质折叠成类似“雪茄”的圆棒状。消除了待电泳粒子的电荷差异及形状差异。从而，在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PA GE)上，不同蛋白质的迁移率仅取决于粒子的分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。三、试剂准备130%储备胶溶液：丙烯酰胺(Acr)29.1 g，亚甲双丙烯酰

42、胺(Bis)0.9 g，混匀后加ddH2O，37溶解，定容至100 mL，过滤后，棕色瓶存于室温。21.5M Tris-HCl(pH 8.8)：Tris 18.17 g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至8.0，定容至100 mL。31M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解， 浓盐酸调pH至6.8，定容至100 mL。410% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68助溶，浓盐酸调至pH 7.2，定容至100 mL。510×电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 20.86 g，甘氨酸100 g，SDS6.94 g加ddH2O溶解，定容至694 mL。610%过硫酸铵(AP)：0.1 g AP加ddH2O至1.0 mL，使用时临时配制。76×SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl