无菌知识培训

1、无菌知识一.无菌相关的概念1.无菌：是指物体或任一介质中没有活的微生 物的存在，即无论用何种方法，检不出活的微生物。2.无菌操作：指在操作中，采用或控制一定的条件，尽量避免产品污染微生物的一种操作方法程序。为此目的，所用的一切物料环境，均应事先灭菌，操作也应在无菌操作室中进行。3.无菌观念：指在无菌操作时，避免污染任何微生物。“无菌”从定义上来说是一个绝对的概念，但遗憾的是，科学和计数高度发展的今天，药品的绝对无菌即做不到，也无法加以证实。然而，无菌制剂的安全性要求人们设定无菌的相对标准。FDA、欧洲制药工业界曾将百分之一微生物污染率作为美军产品“无菌”的相对标准，它和蒸汽灭菌后产品中微生物存

2、活的概率为10-6（即产品的无菌保证值为6），系同一标准的不同表示法。这一标准于1980起收录于USP中，如今已为世界各国普遍接受和采用。二、细胞培养污染与检测 细胞污染的种类可分成细菌、真菌、支原体和病毒。 无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染的血清和污染的细胞等是主要的污染源。 严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好的细胞来源和培养基配制是减低污染的最好方法。细胞培养过程中的主要细胞污染有：1、细菌污染2、真菌污染3、支原体污染4、病毒污染5、黑胶虫污染（1）什么是细菌：细菌是一类细胞细短、结构简单、胞壁坚韧、多以二分裂方式繁殖和水生性较强的原核生物。（2）细菌分类：可根据形状分为三

3、类，即：球菌、杆菌和螺旋菌（包括弧菌、螺菌、螺杆菌）。按细菌的生活方式来分类，分为两大类：自养菌和异养菌，其中异养菌包括腐生菌和寄生菌。按细菌对氧气的需求来分类，可分为需氧（完全需氧和微需氧）和厌氧（不完全厌氧、有氧耐受和完全厌氧）细菌。按细菌生存温度分类，可分为喜冷、常温和喜高温三类。 也可经革兰氏染色法染色将细菌分为两大类：一类最终染成紫色，称为革兰氏阳性细菌（G+），另一类被染成红色，称为革兰氏阴性细菌（G-）1、细菌污染（3）生存条件：凡在温暖、潮湿和富含有机物质的地方，都有各种细菌活动之处。所需条件有： 温度 ：在一定温度范围内，细菌的代谢活动和生长繁殖随着温度的上升而加快。当温度升

4、高到一定限度，开始产生不良影响时，如果温度继续升高，细菌的细胞功能就会受到破坏，以致造成死亡。0停止生长，在-20不会死亡 。 空气湿度：65%75% 水分和空气相对湿度：一般适合食用菌菌丝生长的培养料含水量在60左右。 空气：微量的CO2浓度(0.0340.1) 光照：光照强度为2501000 Lux 5 pH值：喜偏酸性环境，菌丝生长的pH值在36.5之间，最适pH值为5.05.5。大部分细菌在pH值大于7.0时生长受阻，大于8.0时生长停止。（4）细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，最常见的细菌污染主要有枯草杆菌、大肠杆菌等革兰氏阴性菌，白色葡萄球菌也较常见。（5）细菌污染后，培养液p

5、H改变，培养液变得明显混浊，也有的对培养液无肉眼可见影响，只在镜下观察发现菌体时才知已污染，应仔细观察。2、真菌污染（1）什么是真菌：真菌是具有真核和细胞壁的异养生物，具有叶绿体但是无叶绿素不能进行光合作用，具有发达的菌丝体，异样吸收营养，以产生大量无性和（或）有性孢子的方式进行繁殖。大多数真菌生长很快，而只有占少数的致病性真菌生长较慢。（2）常见的主要有酵母菌、霉菌、烟曲霉、黑曲霉、孢子菌、白色念珠菌等（3）生存条件 真菌的生长和繁殖受许多理化因素的影响 温度是最能影响真菌生长繁殖的因素。一般能容许真菌生长的最低温度为0-5，最高为40-45，最适宜浅部真菌生长的温度为22-28，最适宜深部

6、真菌生长的温度为37。 真菌的生长繁殖需要一定的湿度，一般真菌在中等湿度时生长较好。 真菌略偏嗜酸性，在PH5-7之间生长最好。 绝大多数真菌生长时需要氧气，但需氧量不等。高压氧能抑制真菌生长，但不会至死。在氧供应减少时真菌生长缓慢。二氧化碳对皮肤癣菌生长不利，但在一定条件下能刺激某些真菌的孢子形成。 真菌的生长需要营养成分，碳、氮、某些维生素和某些微量元素都是真菌生长所不可缺少的。（4）真菌污染在细胞培养中较常见。真菌种类繁多，形态各异，但污染后易发现，肉眼可见培养基中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的呈散在生长，但培养基一般不发生浑浊。倒置显微镜下观察可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错于细胞

7、之间或培养基中，有的呈链状排列。3、支原体污染（1）什么是支原体：又称霉形体，是一类无细胞壁、介于独立生活和细胞内寄生生活的最小型原核生物（2）繁殖方式多样，主要为二分裂繁殖，还有断裂、分枝、出芽等方式，盖因缺乏细胞壁造成分支原体标本裂时二个子细胞大小均所致。同时，支原体分裂和其DNA复制不同步，可形成多核长丝体。（3）生产条件：营养要求比一般细菌高，除基础营养物质外还需加入1020%人或动物血清以提供支原体所需的胆固醇。最适pH7.88.0之间，低于7.0则死亡。 大多数兼性厌氧，有些菌株在初分离时加入5%CO2生长更好。生长缓慢，在琼脂含量较少的固体培养基上孵育23天出现典型的“荷包蛋样”

8、菌落：圆形（直径1016um），核心部分较厚，向下长入培养基，周边为一层薄的透明颗粒区。（4）支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2m，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。（5）培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。4、病毒污染（1）什么是病毒是一种具有细胞感染性的亚显微粒子，它实际上就是由一个保

9、护性的外壳包裹的一段DNA或者RNA，能以感染态和非感染态两种状态存在。（2）在宿主体内时呈感染态（体细胞内专性寄生），依赖宿主的代谢系统获取能量、合成蛋白质和复制核酸，然后通过核酸与蛋白质的装配而实现其大量繁殖；在离体条件下，不能繁殖，但是它们能以无生命的生物大分子状态长期存在，并可保持其侵染活性。（3）细胞对病毒感染的反应有4种：无明显反应、细胞死亡、细胞增生后死亡和细胞转化5、黑胶虫（1）黑胶虫概况： 在细胞培养的时候，有时会在400倍显微镜下看到小黑点在动，小黑点有时呈点状，有时呈小的片状，运动形式为在原地振动（类似布朗运动），这种小黑点既不是细菌、霉菌，也不是支原体， 目前业内人士称

10、其为“黑胶虫”。（2）黑胶虫一般是存在血清里的，它会不断增多，达到一定数量时会与细胞竞争性生长，与细胞竞争培养基中的营养，从而使得细胞营养不足而死亡。（3）可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液不浑浊。黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代，是一种异养生物。（4）镜下观察细胞生长状态良好，观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。6、污染的预防预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。一般预防可从以下几方面着手:（1）从实验室、物品、用品消毒灭菌着手;（2）从操作者做起，操作者责任心要强，要细心稳重，操 作技术要熟练;（3）防止细胞交叉污染;（4）所有细胞一旦购置或从别处引入，或自己建立，均应及早留种冻存，一旦发生污染可弃之，重新复苏培养。7、污染的清除抗生素处理：预防和杀灭细菌的