酸性磷酸酶的实用教案

1、概 述 酶在物质代谢及调节(tioji)中的重要意义； 常用的酶蛋白分离纯化方法； 酶类检测在临床生化检验中的意义； 酸性磷酸酶作用特性及动力学特点。第1页/共25页第一页，共25页。目 的 要 求1. 巩固诊断酶学有关的理论与实验知识；2. 掌握酶的分离纯化方法；3. 掌握酸性磷酸酶（aicd phosphatase ACP）活性测定的原理(yunl)、方法和影响因素；4. 熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。第2页/共25页第二页，共25页。试剂(shj)与器材一、一、ACP的分离纯化试剂：见实验的分离纯化试剂：见实验(shyn)教材教材P31；二、二、ACP动力学分析试剂动力学分析试剂(

2、shj)：见实验教材见实验教材P35；三、三、器材：普通离心机，器材：普通离心机，721分光光分光光度计，恒温水浴箱，研钵等。度计，恒温水浴箱，研钵等。第3页/共25页第三页，共25页。实 验 内 容一、一、 ACP的分离的分离(fnl)纯纯化化二、二、 ACP的比活性分析的比活性分析(fnx)三、三、 ACP的动力学分析的动力学分析 1. 时间进程时间进程(jnchng)（t-V ）曲线曲线 2. 酶浓度酶浓度-速度（速度（E-V）曲线）曲线 3. pH-酶活性酶活性 （pH-V）曲线）曲线 4.底物浓度底物浓度-速度（速度（S-V）曲线）曲线 5.抑制剂抑制剂-速度（速度（I-V）曲线）曲

3、线第4页/共25页第四页，共25页。一、一、 ACP的分离的分离(fnl)纯纯化化 1.概况：概况： ACP分布分布(fnb)广泛广泛 分子量分子量100kD 最适最适pH5.0 热稳定性较好热稳定性较好 溶解度较高溶解度较高 临床应用广临床应用广第5页/共25页第五页，共25页。2. ACP的分离的分离(fnl)纯化方纯化方法法 根据根据ACP的理化性质，可以用层析、的理化性质，可以用层析、电泳、透析等多种方法分离纯化。电泳、透析等多种方法分离纯化。 本实验采用分级离心本实验采用分级离心+分段盐析法：分段盐析法： ACP与其它成分（细胞膜、杂蛋白与其它成分（细胞膜、杂蛋白(dnbi)）密度不

4、同，以次逐步离心分）密度不同，以次逐步离心分离；离； ACP能溶解于水和低饱和度的硫酸能溶解于水和低饱和度的硫酸铵溶液，在铵溶液，在70C仍保持稳定，以此进行仍保持稳定，以此进行杂蛋白杂蛋白(dnbi)的变性沉淀和分段盐析。的变性沉淀和分段盐析。第6页/共25页第六页，共25页。3.ACP分离分离(fnl)纯化的步纯化的步骤流程骤流程 小麦小麦(xiomi)胚芽胚芽100g+200ml冷蒸馏水冷蒸馏水 滤滤 液液研碎，研碎，4层纱布层纱布(shb)过过滤滤3500rpm，10min离心离心 上清液上清液 I4000rpm，10min离心离心1mol/L MnCl2 2ml/100ml上清液上清

5、液 I 上清液上清液 II（激活并稳定ACP， 沉淀杂蛋白）缓慢搅拌第7页/共25页第七页，共25页。4000rpm，8min离心离心(lxn) 上清液上清液5000rpm，10min离心离心(lxn)饱和饱和(boh)硫酸铵硫酸铵 54ml/100ml上清液上清液 II 上清液上清液 II（溶解ACP， 沉淀杂蛋白）4000rpm，8min离心离心 上清液上清液 III70C水浴水浴2min冷水浴冷水浴3min饱和硫酸铵饱和硫酸铵 51ml/100ml上清液上清液 II 沉淀沉淀（酶粗提物）（酶粗提物）（ 沉淀ACP）缓慢搅拌缓慢搅拌第8页/共25页第八页，共25页。4000rpm，10mi

6、n离心离心(lxn)约约1/3上清液上清液 III蒸馏水，蒸馏水，溶解溶解(rngji)，洗涤，洗涤（溶解ACP， 沉淀(chndin)杂蛋白）4000rpm，10min离心离心 上清液上清液 IV 沉淀沉淀（酶粗提物）（酶粗提物）（ 沉淀ACP）EDTA9ml，饱和硫酸铵，饱和硫酸铵10ml /100ml上清液上清液 IV，2倍体积预冷甲醇倍体积预冷甲醇 沉沉 淀淀（酶纯化物）（酶纯化物）4000rpm，10min离心离心蒸馏水溶解，洗涤蒸馏水溶解，洗涤 上清液上清液 V （酶液）（酶液）缓慢搅拌第9页/共25页第九页，共25页。 1.各上清液中蛋白质含量测定各上清液中蛋白质含量测定 原理：

7、染料结合比色法原理：染料结合比色法CBBG-250，max=595nm； 步骤：标准步骤：标准(biozhn)曲线制作曲线制作 各上清液中总蛋白测定（做平行管，各上清液中总蛋白测定（做平行管，进进 行重复实验，减少随机误差。行重复实验，减少随机误差。二、二、 ACP的比活性分析的比活性分析(fnx)第10页/共25页第十页，共25页。 2.各上清液中各上清液中ACP活性测定活性测定(cdng) 酚酚-4-AAP显色法显色法:以磷酸苯二钠为底以磷酸苯二钠为底物，由物，由ACP催化生成苯酚，在碱性条件下催化生成苯酚，在碱性条件下苯酚与苯酚与4-AAP缩合最终生成红色醌类化合缩合最终生成红色醌类化合

8、物，物，max = 510 nm； 注意：显色过程中两种缓冲液：注意：显色过程中两种缓冲液： 柠檬酸缓冲液：柠檬酸缓冲液：pH5.0，提供，提供ACP反应反应条件条件 碳酸盐缓冲液：碳酸盐缓冲液：pH10.0，提供成色反应，提供成色反应条件条件第11页/共25页第十一页，共25页。 3.各上清液中各上清液中ACP比活性分析比活性分析(fnx) ACP活性单位定义：每分钟每毫升酶活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生液产生1nmol酚即酚即nmol/minml为为1个活个活性单位；性单位；纯化(chn hu)倍数=各上清液中ACP的比活性上清液I 中ACP的比活性比活性=酶活性 U/ml蛋白质含量(

9、hnling)mg/ml酶的回收率=各上清液中ACP的活性 总体积上清液I中ACP的活性 总体积还可以计算蛋白回收率，反映纯化效果，代表方法的特异性。第12页/共25页第十二页，共25页。三、三、 ACP的动力学分析的动力学分析(fnx) 1. 时间进程时间进程(jnchng)（t-A ）曲线曲线AACP的的 t-A 曲线曲线(qxin)时间（t）酚生成量第13页/共25页第十三页，共25页。2. 酶浓度酶浓度-速度速度(sd)（E-A）曲）曲线线 酶蛋白(dnbi)含量（E）反应速度(fn yng s d)VACP 的的 E-V 曲线曲线第14页/共25页第十四页，共25页。 3. pH-酶

10、活性酶活性 （pH-V）曲线）曲线(qxin)pH反应速度(fn yng s d)V最适pHACP的的pH-酶活性曲线酶活性曲线(qxin)第15页/共25页第十五页，共25页。1.影响方式： 当S较低时，V随S的 增加呈正比例增加 当S较高时，V随S的 增加减慢(jin mn) 当S增大到某一值时，V 达到最大反应速度Vmax2.影响(yngxing)曲线：VSVmax（矩形(jxng)双曲线）Km4.底物浓度底物浓度-速度（速度（S-V）曲线）曲线第16页/共25页第十六页，共25页。曲线(qxin)方程米-曼氏方程（1）米-曼氏方程(fngchng)： V=VmaxSKm + SV： 某

11、一时刻(shk)的反应速度S：某一时刻的底物浓度Vmax： 反应系统能够达到的最大反应速度Km：米氏常数第17页/共25页第十七页，共25页。 Km和Vmax的测定： 双倒数作图法：将米氏方程(fngchng)两边取倒数得 1 1 1V Vmax S Vmax=+1V 1S纵截距=KmKmVmax斜率(xil)=Vmax1横截距=1Km-第18页/共25页第十八页，共25页。1.抑制剂的概念： 抑制剂（inhibitor）：能使酶的催化活性下降而 不引起酶蛋白(dnbi)变性的物质2.抑制作用的分类(fn li)：抑制作用不可逆性抑制(yzh)可逆性抑制竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制 5.抑制剂抑制剂-速度（速度（I-A）曲线）曲线第19页/共25页第十九页，共25页。 竞争性抑制(yzh)的动力学变化米-曼氏方程(fngchng)变化为： V=VmaxSKm（1+I/Ki） + S此时(c sh)， Km增大， Vmax不变1/V1/SE + I EIKi无抑制剂有抑制剂第20页/共25页第二十页，共25页。KH2PO4对ACP 的抑制(yzh)分析1/V1/S无抑制剂有抑制剂分析抑制(yzh)类型KH2PO4对ACP 的抑制作