高效液相色谱详解

1、会计学1高效液相色谱详解高效液相色谱详解第1页/共112页第2页/共112页一、基础理论一、基础理论第3页/共112页第4页/共112页 色谱分析法的分类色谱分析法的分类v按两相的状态分类按两相的状态分类流动相流动相液体液体流动相流动相气体气体固定相固定相固体固体液体液体固定相固定相固体固体液体液体名称名称液固色谱液固色谱液液色谱液液色谱名称名称气固色谱气固色谱气液色谱气液色谱总称总称液相色谱液相色谱总称总称气相色谱气相色谱第5页/共112页第6页/共112页第7页/共112页第8页/共112页洗脱方式低压梯度等度洗脱高压梯度第9页/共112页等度洗脱输输液液泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱

2、柱温箱检测检测器器第10页/共112页梯度洗脱 A 泵泵进样进样器器色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器 B泵泵AB时间时间B 浓浓度度第11页/共112页MeOH / H2O = 4 / 6MeOH / H2O = 8 / 2等度洗脱等度洗脱第12页/共112页95%30%MeOH 浓浓度度梯度洗脱第13页/共112页梯度洗脱是梯度洗脱是 HPLC 的常用手段的常用手段 梯度洗脱装置梯度洗脱装置 流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的组成，以调节它的极性，使样品中每个组分都有较高的分离度，从而实现各组分的圆满分离，梯度洗脱可提高柱效，缩短分析时间，改善

3、检测器的灵敏度，它类似于气相色谱的程序升温技术。第14页/共112页第15页/共112页第16页/共112页第17页/共112页数据分析系统进样系统进样系统分离系统分离系统检测系统检测系统数据处理系统数据处理系统HPLC的系统组成第18页/共112页储液瓶真空脱气机混合室自动进样器分离柱VWD第19页/共112页第20页/共112页第21页/共112页功能：功能：组分分离组分分离目标：目标：分辨力强分辨力强效率高效率高第22页/共112页第23页/共112页第24页/共112页升温对于反相升温对于反相 HPLC分离强疏水肽的影响分离强疏水肽的影响 (B27)流动相流动相: A: 含含0.05%

4、三氟乙酸的水三氟乙酸的水B: 含含0.05%三氟乙酸的乙腈三氟乙酸的乙腈2% B / min进样量进样量: 100L (50g的的6M脲脲/5%乙酸乙酸)UV: 210 nm流速流速: 1 mL/min室温室温液相色谱柱液相色谱柱: C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5m室温室温300C400C500C600C700C提高柱温，可增加柱提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）效（提高灵敏度）第25页/共112页检测器选择性紫外紫外(VWD(VWD、DAD)DAD)荧光荧光电化学电化学通用型示差折光示差折光蒸发光散射蒸发光散射质谱质谱检测系统检测系统第26页/共112页第27页/

5、共112页紫外吸收紫外吸收检测器（检测器（UVD）原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的 变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波长可变和光二极管阵列三种类型。特点：选择性检测器、波长检测范围：190-800nm ；对流量和温度敏感性低、灵敏度较高（10-9g）；应用最广，对大部分有机化合物有响应；对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。定量基础：Lambert-Beer定律，AKbc第28页/共112页2022-7-2紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长

6、，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。检测器简介（二）检测器简介（二）第29页/共112页检测器简介（三）检测器简介（三）第30页/共112页第31页/共112页 示差示差折光指数折光指数检测器（检测器（RIDRID）原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度的检测器。特点：通用性检测器，温变化要保持在0.001、灵敏度低（10-6g） 第32页/共112页第33页/共112页第34页/共112页样品准备样品完全溶解在流动相中样品没有完全溶解过滤样品，确保样品中不含固体颗粒用流动相或比流动相弱的溶剂溶解样品进样量尽量小第35页/共112页第36页/共112页第37页/共112

7、页第38页/共112页第39页/共112页第40页/共112页第41页/共112页准备流动相准备流动相第42页/共112页第43页/共112页过滤装置第44页/共112页第45页/共112页3) 溶剂准备：脱气溶剂准备：脱气第46页/共112页第47页/共112页第48页/共112页柱子的内径（5m填料）流速（ml/min）4.61 - 23.00.4 - 0.82.10.2 - 0.41.00.05 - 0.09第49页/共112页v首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值，如吸

8、收度小于0.5时，HPLC测定的面积将会很小。第50页/共112页第51页/共112页第52页/共112页第53页/共112页逆时针打开清洗阀顺时针关闭清洗阀毛细管出口,流向进样器废液管,清洗阀打开时溶剂由此流向废液瓶.第54页/共112页第55页/共112页第56页/共112页第57页/共112页第58页/共112页指示灯状态指示灯状态每个部件接通电源后LED灯显示绿色关机 power off准备进样 power on没准备好Not Ready运行Run故障Error驻留ResidentBlink仪器LED状态显示电源开关显示黑Black黑Black黄Yellow绿Green红Red黄闪烁Y

9、ellow blinking6种LED仪器状态：第59页/共112页第60页/共112页第61页/共112页文件处理运行控制仪器控制序列放弃任务在线帮助工作站任务切换快捷键方法存取快捷键方法存取快捷键序列存取快捷键运行方法运行序列第62页/共112页第63页/共112页第64页/共112页在Method中点击Load Method工作站弹出下面对话框.在右面对话框中选中要调用的方法名,点击“OK”,该方法即被激活.第65页/共112页使用 Edit Entire Method 编辑一个完整的方法第66页/共112页画面1:方法组成在你想要的部分前选中,否则方法里将不包括该部分的内容。比如本方法

10、不包括数据分析的内容。方法信息仪器控制与数据采集数据分析运行时间表第67页/共112页画面2：方法信息输入您想要对方法的说明，比如方法的用途、来源等信息。第68页/共112页包括：流量(Flow)，流动相组成(Solvents)，停止采集时间(Stop Time)，梯度编程(Timetable)，压力限制设定(Pressure Limits)压力限制：Max最高压力，Min最低压力流动相梯度表输入流量(Flow)输入停止采集时间(Stop Time)输入流动相组成，B、C、D可输，A=100-B-C-D输入流动相名称画面3：泵参数（四元泵）第69页/共112页画面5：检测器参数VWD输入使用的

11、波长第70页/共112页l控温范围：低于室温1080l两个单独的加热区。 l安装切换阀可以进行柱切换。l可以容纳30 cm长色谱柱。l安装柱识别可以自动记录进样次数。画面6：恒温柱箱参数设置输入控制温度温度编程表第71页/共112页从Method菜单选择Save Method / Save Method as或从存贮方法工具图标存贮方法。换名保存覆盖保存另存时在此处输入方法名第72页/共112页第73页/共112页要分析单个样品, 从RunControl菜单选择 Sample Info., 输入样品信息。样品信息包括：操作者姓名(Operator Name)，存盘数据文件(Data File)

12、，样品参数(Sample Parameters)。然后运行方法(Run Method)。样品瓶所放位置子目录名称数据形式Manual为手动，Prefix/Counter为自动累加。第74页/共112页鼠标左键点击红色或蓝色标题，即可将Y轴显示成对应的相应值和单位第75页/共112页第76页/共112页 调用信号文件叠放多个信号文件第77页/共112页第78页/共112页Signal Options信号选项第79页/共112页第80页/共112页Integration Events积分参数选项（及快捷键）第81页/共112页Slope Sensitivity设置斜率灵敏度，截除噪音积分Peak

13、Width设置半峰宽度，远大于或小于该数值的峰的积分将被截除Area Reject设置面积截除，截除面积低于此值的峰的积分Height Reject设置峰高截除Shoulders设置肩峰参数第82页/共112页这是一张优化了积分参数的谱图积分，噪音及杂质积分已被截除。第83页/共112页第84页/共112页第85页/共112页第86页/共112页第87页/共112页第88页/共112页现 象原 因排除方法1.柱前导管接头漏液2.泵柱室内有大量气泡存在3.贮液瓶内试剂用完4.输液泵未工作1.检查各接口是否有漏液；2.放开泵出口接头；用“清洗”键冲洗泵体；3.添加流动相；4.按输液泵操作方法，检查

14、其工作状态。第89页/共112页现 象原 因排除方法1.分离柱阻力过大(陈旧柱子)2.柱前导管堵塞3.泵柱塞内有少量气泡存在4.柱子进口处过滤膜堵塞5.进样阀手柄未旋到底(处于中间状态)6.导管中有颗粒状固体堵塞1.更换柱子2.从柱后开始逐级向上拆开接头检查3.拆开泵接头，用“清洗”档赶尽气泡。4.拆开柱前接头、更换或清洗过滤膜5.左右旋动六通阀至极限位置6.逐级检查，并更换导管第90页/共112页现 象原 因排除方法1.流动相中存在大颗粒的物质2.样品未经过过滤处理3.柱子输入端滤片污染1.流动相经5m的真空抽滤瓶过滤后再使用2.样品须经滤膜过滤3.拆下柱的滤片用超声波清洗，同时刮去柱口表面

15、被污染的固定相1.流通池内留有大量的气泡2.流通池漏液3.紫外检测器有故障1.排除气泡2.检修流通池3.停止恒流泵工作，检查紫外检测器第91页/共112页现 象原 因排除方法1.波长选择不正确2.检测器输出衰减 太大3.进样口漏液4.进样阀样品废液管堵塞，样品未进入定量管 5.进样后未按启动键6.定量管容积过小7.样品浓度过稀8.检测器灯源老化或失效9.流动相不纯1.按标准重新选择波长2.重新选择输出量程范围3.修理进样阀4.拆下六通阀上废液管(5#，6#)重新安装5.进样后立即按启动键6.更换大容量定量管7.浓缩样品后再进样8.更换灯源9.选择高纯度的流动相第92页/共112页现 象原 因排

16、除方法1.设置温度值过低2.柱箱密封盖未盖好3.温度控制器未启动4.柱箱升过高温后， 再设置低温5.温控部件有故障6.控温铂电阻接触 不良1.设置最低温度应 室温以上102.检查柱安装过程3.按 起始 键(指示灯 亮)4.开机后会逐渐稳定 (正常现象)5.修理温度控制器6拧紧固定铂电阻引 线的螺钉第93页/共112页现 象原 因排除方法检测器开机时屏幕 显示不正常，出现缺字、坐标图形异样、光标无法移动等现象。工作电源不正常或仪器附件有强干扰源存在。1.检查工作电源电压，采取稳压措施2.关机后重新开机3.检测器微机系统故障第94页/共112页图图 谱谱分析原因分析原因现象说明及排除现象说明及排除

17、1.环境温度变化过大环境温度变化过大2.液流不稳定或有漏液液流不稳定或有漏液3.在技术指标范围内在技术指标范围内1.避开室内通风口位避开室内通风口位 置和发热或制冷源置和发热或制冷源2.观察泵的工作状态观察泵的工作状态, 并查漏并查漏3. 110-4Au第95页/共112页图图 谱谱分析原因分析原因现象说明及排除现象说明及排除1.外界干扰讯号外界干扰讯号2.输液泵柱室内有气泡输液泵柱室内有气泡3.流通池内有气泡流通池内有气泡1.使机壳良好接地，使机壳良好接地， 排除附近干扰源排除附近干扰源2.用用“清洗清洗”键或排键或排 放阀排除气泡放阀排除气泡3.拆下输入导管，大拆下输入导管，大 流量冲洗池

18、体或在流量冲洗池体或在 池体出口增加阻力池体出口增加阻力 (接长排液导管接长排液导管)漂移漂移1.仪器在稳定中仪器在稳定中2.在技术指标范围内在技术指标范围内3.柱箱升过高温后，柱箱升过高温后， 再处于室温工作再处于室温工作4.检测器工作不稳定检测器工作不稳定1.正常现象正常现象2.属正常状态属正常状态3.将分离柱从柱箱将分离柱从柱箱 内取出后使用内取出后使用4.元器件工作点不稳元器件工作点不稳 定，修理后再使用定，修理后再使用第96页/共112页图图 谱谱分析原因分析原因现象说明及排除现象说明及排除1.组份分离不佳组份分离不佳 a.色谱柱选择有误色谱柱选择有误 b.流动相不符合分析要求流动相

19、不符合分析要求 c.柱后导管过长柱后导管过长2.波长选择不正确波长选择不正确3.流速过大流速过大1.重叠峰重叠峰 a.更换色谱柱更换色谱柱 b.重新选择流动相重新选择流动相 c.尽可能减短柱后导管长度尽可能减短柱后导管长度2.重选波长，增大组重选波长，增大组 份的吸光度差异份的吸光度差异3.减小流量值减小流量值1流动相已用完流动相已用完2温度控制器失控温度控制器失控 (恒温开启条件下恒温开启条件下)3在工作过程添加在工作过程添加 流动相流动相1.突然漂移大多为突然漂移大多为 流动相用完造成流动相用完造成2.检查温度控制器检查温度控制器3.尽可能不要在工作尽可能不要在工作时加流动相，可采用时加流

20、动相，可采用较大的贮液瓶较大的贮液瓶第97页/共112页图图 谱谱分析原因分析原因现象说明及排除现象说明及排除1放大器量程选择放大器量程选择 过大过大2放大器无输出放大器无输出3二次仪表或检测器二次仪表或检测器 失效失效1.减小量程范围减小量程范围(若接若接 积分仪，可减小仪积分仪，可减小仪 器的满度电压值器的满度电压值)2. 未按起始键未按起始键 3.更换失效的部件更换失效的部件基线无噪声基线无噪声出倒峰出倒峰1.组份吸光度小于流组份吸光度小于流 动相的吸光度动相的吸光度2.流动相在该波长的流动相在该波长的 透过率透过率100%3.输出讯号极性接反输出讯号极性接反1.属正常情况属正常情况2.

21、选择百分透过率为选择百分透过率为 100%级别的液相级别的液相 专用流专用流 动相动相3.对换二次仪表讯号对换二次仪表讯号 线的极性线的极性第98页/共112页图图 谱谱分析原因分析原因现象说明及排除现象说明及排除1.进样器污染进样器污染2.流通池污染流通池污染3.灯源老化灯源老化4.检测器放大器失调检测器放大器失调1.进样多次或进过浓进样多次或进过浓 样品后未清洗进样样品后未清洗进样 阀造成阀造成2.清洗池体。多次进清洗池体。多次进 样后未清洗池体或样后未清洗池体或 久日未使用后重新久日未使用后重新 开机时易发生开机时易发生 3.使用时间已大于使用时间已大于 1000小时小时 4.重调放大器

22、重调放大器噪声过大噪声过大第99页/共112页天然产物提取天然产物提取绿原酸标品(99.8%)85.2%绿原酸产品93.4%绿原酸产品第100页/共112页食品安全检测食品安全检测盐酸克伦特罗盐酸克伦特罗第101页/共112页建立了同时测定小柴胡颗粒中环磷酸腺苷、黄芩建立了同时测定小柴胡颗粒中环磷酸腺苷、黄芩苷和甘草酸含量的方法，色谱柱：苷和甘草酸含量的方法，色谱柱：Zorbax TC-C18柱（柱（5 m，150 mm 4.6 mm），流动相：甲醇），流动相：甲醇（A）：）：0.01MKH2PO4(B)（10：90）（）（0min）A：B（10：90）（）（12min）A：B（70：30）（

23、）（17min）A：B（10：90）（）（30min）；检测波）；检测波长：长：250nm；流速：；流速：1.0mL/min；进样量：；进样量：50uL；柱温：；柱温：30。药物检测药物检测第102页/共112页建立了一种同时测定三种氨基甲酸酯类建立了一种同时测定三种氨基甲酸酯类农药（速灭威、克百威、抗蚜威）的检农药（速灭威、克百威、抗蚜威）的检测方法，检测条件为：色谱柱：测方法，检测条件为：色谱柱： Agilent TC-C18（4.6mm250mm，5um）；流动相：甲醇（）；流动相：甲醇（A）：水（）：水（B）梯度洗脱，梯度洗脱，0到到20min，从，从100%B到到100%A；检测波长：；检测波长：0-17min，258nm；17-18min，276nm；18-20min，245nm；柱温：；柱温：30；进样量：；进样量：20l。在此检测条件下，速灭威、克百威、抗在此检测条件下，速灭威、克百威、抗蚜威在蚜威在20min与杂质得到较好的分离。与杂质得到较好的分离。农药环境污染农药环境污染第103页/共112页【作者作者】 美）美）L.R.施奈德（施奈德（L.R.Snyder） 等著；等著；【出版日期出版日期】1998.09【出版社出版社】北京：科学出版社北京：科学出版社【ISBN】7-03-006615-4【中图分类号中图分类号】O652.63第10