DB41∕T 2171-2021 牛妊娠诊断技术规程

1、 ICS 65.020.30CCS B 4341河 南 省 地 方 标 准DB41/T 21712021牛妊娠诊断技术规程2021-10-19发布2022-01-18实施 DB41/T 21712021目次前言. II1范围. 12规范性引用文件 . 13术语和定义 . 14直肠检查 . 15超声波诊断 . 26妊娠相关糖蛋白检测 . 2附录A（规范性）直肠检查法不同妊娠时期牛子宫变化示例. 5附录B（规范性）牛配后各时期B型超声波子宫切面示例. 7附录C（规范性）溶液配制方法和要求. 9I DB41/T 21712021前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件

2、的结构和起草规则的规定起草。II DB41/T 21712021牛妊娠诊断技术规程1范围本文件规定了直肠检查、超声波诊断、妊娠相关糖蛋白（pregnancy-associated glycoproteins,PAGs）检测等牛妊娠诊断方法的操作技术规程。本文件适用于牛妊娠诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 10152 B型超声诊断设备NY/T 3471畜禽血液收集技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.13.

3、2妊娠诊断采用临床或实验室的方法检查配种一定时间内的母牛是否妊娠、妊娠时间及胎儿发育情况的方法。孕囊在胚胎发育的最初几周内围绕胚胎充满液体的结构，也是牛妊娠过程中通过超声发现妊娠的第一个结构。3.3妊娠相关糖蛋白母牛妊娠后胎盘的滋养层双核细胞与子宫上皮细胞融合后释放的一种蛋白。一般最早可在妊娠15d21d的怀孕母牛血液中检测到，产后90d后浓度降至最低。4直肠检查4.1动物准备动物使用颈夹或保定架保定配种45d后的母牛。4.2人员准备操作人员检查手指甲并将手指甲剪短磨平，穿戴已消毒的工作服，操作手臂佩戴一次性长臂手套，并在手套外涂抹润滑剂。4.3排空蓄粪1 DB41/T 21712021操作人

4、员直检手手指并拢，以4560角缓慢进入直肠，排空蓄粪。4.44.5确定子宫颈位置操作人员手臂前伸，摸到子宫体，顺子宫体回撤手臂，确定子宫位置。妊娠诊断操作人员经直肠触摸探查母牛两侧子宫角是否存在大小和质地差异，判断是否存在孕囊和子叶，并跟踪大小变化情况，从而确定母牛是否妊娠。妊娠期牛子宫变化应符合附录A的规定。4.6检查结束检查结束后，将使用过的手套和工作服进行处置，同时记录检查结果。5超声波诊断5.1动物准备使用颈夹或保定架保定配种32d60d的母牛。5.25.35.4人员准备按4.2。排空蓄粪按4.3。开机自检选用符合GB 10152的B超仪。打开B超仪开关，待仪器设备自检正常后，设置或调

5、整设备相关参数，按设备要求进行预热，根据B超仪屏幕影像质量调节灰度、对比度、增益度及近场、远场信号强度。5.5获取影像在B超仪探头部位涂抹相应耦合剂，将B超探头缓慢送入直肠30cm50cm处，深度可根据牛体型和妊娠状况进行适当调整，紧贴子宫不断缓慢移动调整探查角度，直至清晰影像出现。5.6妊娠诊断出现一个或多个规则的孕囊（黑色暗区）或者胎儿骨骼影像即可确认为妊娠。妊娠期牛子宫内孕囊及胎儿变化应符合附录B的规定。5.7检查结束检查结束后，将使用过的手套和工作服进行处置，擦拭B超仪探头并使用75%的酒精进行消毒，同时记录检查结果。6妊娠相关糖蛋白检测样品准备6.12 DB41/T 21712021

6、采集配种28d后牛只血液并分离血清。采样、运输过程应符合NY/T 3471的相关要求。6.26.3实验前准备实验室温度调节设置1825，并准备恒温箱、混匀器、酶标仪等仪器设备。检测程序6.3.1试剂配制配制方法按附录C规定。6.3.2包被用包被液将牛PAGs单克隆抗体稀释至工作浓度，加入酶标板孔中，每孔100L（每孔抗体含量约35ng），在28放置12h。6.3.3洗涤弃去孔内包被液，用洗涤液洗板3次，每次300L/孔，洗涤完毕后在吸水纸上拍干。6.3.4封闭每孔加入200L的封闭液，置37孵育1h。按6.3.3规定操作。6.3.5加入待检样品每孔加入50L样品缓冲液。分别将100L标准品（A

7、F）和样品加入到相应孔中，加样后轻轻震荡混匀。覆膜，37孵育60min或室温（1825）孵育90min。6.3.6洗板孵育后洗板，甩尽酶标板内液体，每孔加300L洗涤液洗板，并在吸水纸上拍干，反复洗涤5次。6.3.7加入酶标兔抗牛PAGs多克隆抗体用洗涤液将酶标兔抗牛PAGs多克隆抗体稀释至标定浓度，每孔加100L酶标兔抗牛PAGs多克隆抗体，覆膜，37避光孵育60min或室温（1825）避光孵育90min。6.3.8洗板重复6.3.6的操作，并用干净纸巾将酶标板底部擦拭干净。6.3.9显色反应每孔加100L底物溶液。勿覆膜，室温（1825）避光孵育30min。6.3.10终止反应孵育完成后，

8、每孔加50L反应终止液，轻轻晃动混匀。6.3.11上机检测15min内用酶标仪在450nm波长处测量各孔的光密度（OD值）。6.3.12计算结果3 DB41/T 21712021以标准品的浓度为横坐标（X），OD值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，相关系数（R）应大于等于20.99。根据样品的OD值利用标准曲线计算出样品中PAGs浓度。6.4结果判断被检牛只PAGs检测浓度1 000pg/mL时，结果判断为妊娠；PAGs检测浓度300pg/mL时，结果判断为空怀状态；300pg/mLPAGs检测浓度1 000pg/mL时，结果判断为高风险，存在胚胎死亡风险，建议2周后复检。4 DB41/T 217

9、12021AA附录 A（规范性）直肠检查法不同妊娠时期牛子宫变化示例A.1未孕牛子宫卵巢均位于骨盆腔内，2个子宫角大小相等，形状相似，弯曲如绵羊角状，角间沟清楚明显。触诊子宫有弹性，子宫角有收缩反应。卵巢上无妊娠黄体。A.2怀孕牛A.2.1初期：子宫变化不大，子宫壁有弹性，孕角侧卵巢上有突出于卵巢表面的黄体，同时观察是否返情。A.2.2 1个月：孕角增厚变粗，不收缩，有弹性，孕角内有液体波动。空角收缩，有弹性，弯曲明显，角间沟清楚。图 A.1妊娠1个月子宫情况示例A.2.3 2个月：角间沟不清楚，分岔明显，子宫角、卵巢向腹腔沉入，孕角比空角大一倍，子宫角壁软而薄，有波动。图 A.2妊娠2个月子

10、宫情况示例A.2.4 3个月：角间沟消失，子宫颈移至耻骨前缘，孕角有明显波动，有胎动。孕侧子宫中动脉开始出现较弱孕脉。5 DB41/T 21712021图 A.3妊娠3个月子宫情况示例A.2.5 4个月：子宫沉入腹腔，可清楚摸到子叶，体积稍小于卵巢（如黄豆大小），孕侧子宫中动脉较清楚。A.2.6 5个月：两侧卵巢全沉入腹腔，不能或只能摸到子宫的一部分，子叶更大（如蚕豆大小），孕侧子宫中动脉明显，非孕侧出现孕脉。A.2.7 6个月：胎儿进入腹腔，子叶更大（如鸽子蛋大小），子宫中动脉粗大，孕脉明显。A.2.8 7个月：子叶如核桃大，两侧子宫中动脉均明显。A.2.9 8个月：子叶更大，两侧中动脉孕脉

11、显著，胎儿上移。A.2.10 9个月：前置部分进入骨盆入口，两侧子宫动脉有显著孕脉。6 DB41/T 21712021BB附录 B（规范性）牛配后各时期B型超声波子宫切面示例B.1各时期B型超声波子宫切面示例出现一个或多个规则的孕囊暗区或者胎儿骨骼影像即可确认为早孕阳性（图B.2），否则为早孕阴性（图B.1）。图 B.1未孕子宫角图 B.2子宫内囊暗区牛孕后27 d（图B.3）、30 d（图B.4）、32 d（图B.5）、43 d（图B.6）、59 d（图B.7）、66 d（图B.8）的B型超声波子宫切面图示例如下：图 B.3妊娠第27 d图 B.4妊娠第30 d7 DB41/T 217120

12、21图 B.5妊娠第32 d图 B.6妊娠第43 d图 B.7妊娠第59 d图 B.8妊娠第66 dCC8 DB41/T 21712021D附录 C（规范性）溶液配制方法和要求C.1洗涤液将下列试剂按次序加入1000mL规格的容器中，加入800mL蒸馏水充分溶解，用1mol/L盐酸（HCl）或1 mol/L氢氧化钠（NaOH）调节至pH 7.4，定容至1 000mL。氯化钠（NaCl）8.0g氯化钾（KCl）0.2g磷酸氢二钠（Na2HPO4-12H2O）磷酸二氢钾（KH2PO4）吐温-20（Tween-20）加蒸馏水至0.2g2.9g0.5mL1 000mLC.2包被液包被液为碳酸盐缓冲液（0.025mol/L，pH9.6）。将下列试剂按次序加入1000mL规格的容器中，加入800 mL蒸馏水充分溶解，用1 mol/L盐酸（HCl）或1 mol/L氢氧化钠（NaOH）调节至pH 9.6，定容至1 000 mL。碳酸钠（Na2CO3）碳酸氢钠（NaHCO3）加蒸馏水至1.59g2.93g1 000mLC.3C.4封闭液（5%脱脂奶）洗涤液100m