常用分子生物学技术的原理及应用55549PPT教案

1、会计学1常用分子生物学技术的原理及应用常用分子生物学技术的原理及应用55549第1页/共52页核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹技术的原理第2页/共52页复性RNADNA第3页/共52页（一）印迹技术（二）探针技术 探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核

2、苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 第4页/共52页二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 第5页/共52页 其他斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization)DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip)第6页/共52页三种印迹技术的比较第7

3、页/共52页分子杂交实验目 录第8页/共52页放射自显影照片目 录第9页/共52页DNA点阵目 录第10页/共52页第11页/共52页5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA55 555 5 55一、基本工作原理目 录第12页/共52页Cycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目 录第13页/共52页n模板DNAn 特异性引物n耐热DNA聚合酶n dNTPsn Mg2+ 二、PCR体系基本组成成分第14页/共52页三、PCR的基本反应步骤变性95C延伸

4、72C退火Tm-5C第15页/共52页（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析四、PCR的主要用途第16页/共52页第17页/共52页实时PCR技术原理目 录第18页/共52页第19页/共52页核酸序列分析的基本原理化学裂解法 (Maxam-Gillbert法)DNA链的末端合成终止法 (sanger法)第20页/共52页一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获

5、得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记DNA的5末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。第21页/共52页二、DNA链末端合成终止法第22页/共52页目 录第23页/共52页三、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 第24页/共52页DNA自动测序结果举例目 录第25页/共52

6、页第 四 节第26页/共52页基因组DNA文库 (genomic DNA library)cDNA文库 (cDNA library) 基因文库 (gene library)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。第27页/共52页基因组DNA文库目 录第28页/共52页第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例第29页/共52页第 五 节第30页/共52页克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆(functional cloning)（二）定位克隆(positional cloning)（三）非定位候选基因克隆策略(position- independent candidat

7、e gene approaches)（四）定位候选基因克隆策略(positional candidate gene approaches )第31页/共52页定义 从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。（一）功能性克隆应用 生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。第32页/共52页克隆方式 利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库； 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。 功能互补试验 (functional complementation assay)利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。 第33页/共52页（二）定位克隆定义从一种致病基因的

8、染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作 遗传学分析(确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析 分子生物学分析染色体异常(缺失、易位等)分析、基因文库的筛选与基因克隆第34页/共52页第35页/共52页（四）定位候选基因克隆策略当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。第36页/共52页The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model 第37页/共52页转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后

9、将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。 转基因被导入的目的基因转基因动物(transgenic animal)目的基因的受体动物一、转基因技术第38页/共52页二、核转移技术第39页/共52页目 录第40页/共52页基因剔除技术也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。三、基因剔除技术第41页/共52页第42页/共52页第 七 节 生 物 芯 片 技 术Biological Chip Technology第43页/共52页DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip)是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固

10、定于单位面积的支持物上 。一、基因芯片(gene chip)第44页/共52页目 录第45页/共52页是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)第46页/共52页第 八 节蛋白质相互作用研究技术Research Technology of Interaction of Protein第47页/共52页蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。 蛋白质之间相互作用研究的重要性第48页/共52页酵母双杂交各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示