第七章免疫组织化学技术

1、免疫组织化学技术Albert Hewett Coons（19121978）20世纪40年代Coons利用FITC标记抗体成功地检测了小鼠肺脏组织内存在的肺炎双球菌多糖抗原，标志着免疫组化技术的诞生。 免疫组织化学技术（Immunohistochemistry） 免疫学技术与组织化学技术相结合的产物，它以抗原抗体特异性反应为基础，并结合化学的呈色反应，最后在组织/细胞层面原位显示跟踪物质的位置，综合反映了静态的组织细胞形态和组成以及动态的机体功能代谢生理状态。第九章 免疫组织化学技术第一节 免疫组织化学技术的类型第二节 免疫组织化学技术基本流程第九章 免疫组织化学技术第一节 免疫组织化学技术的类

2、型第二节 免疫组织化学技术基本流程免疫组织化学技术的类型1. 按标记物的不同分类2. 按反应方式的不同分类3. 按应用方式不同分类 1按标记物的不同分类（1）免疫荧光组织化学技术（immunofluorescence cytochemistry）（2）免疫酶组织化学技术（immunoenzymatic cytochemistry）（3）免疫铁蛋白组织化学技术（immunoferritin cytochemistry）（4）免疫胶体金组织化学技术（immuno-colloidal gold cytochemistry）（5）放射免疫组织化学技术（radio-immunocytochemistry

3、） 按反应方式的不同分类（1）直接标记法（direct labeling）（2）间接标记法（indirect labeling）（3）抗体桥联法（immunobridge）（4）抗酶抗体法（peroxidase - antiperoxidase）（5）半抗原夹心法（hapten sandwich）（6）葡萄球菌蛋白介导的免疫组织化学方法（protein A immunocytochemistry）（7）生物素-亲合素系统介导的免疫组织化学方法（biotin-avidin system cytochemistry）3按应用方式不同分类（1）免疫电镜组化技术（immunoelectromicros

4、copy cytochemistry）（2）双标记或多重染色组化技术（double labeling cytochemistry）（3）定量免疫组化技术（quantitative immunocytochemistry）（4）原位杂交与免疫组化技术（in site hybridization and immunocytochemistry）第九章 免疫组织化学技术第一节 免疫组织化学技术的类型第二节 免疫组织化学技术基本流程免疫组织化学技术基本流程一、样品的制备二、抗原抗体反应三、化学呈色反应四、免疫组织化学结果及其分析免疫组织化学技术基本流程一、样品的制备二、抗原抗体反应三、化学呈色反应四、

5、免疫组织化学结果及其分析组织的取材 动物标本 手术活检标本 尸体解剖标本 细胞标本动物的处死 空气栓塞法 麻醉法 断头法 颈椎脱臼 股/颈动脉放血法取材注意事项 迅速 干脆 注意保持组织的完整性和代表性活检标本 注意区别病变组织、边缘组织和正常组织 肾穿刺标本 小标本细胞的取材（Drawing materials） 印片 穿刺涂片 体液沉淀涂片 培养细胞组织切片技术 冰冻切片 石蜡切片取材 固定 洗涤和脱水 透明 浸蜡 包埋 切片与粘片 烤片 脱蜡 水化 染色 封片 固定（Fixation）将组织置于某些化学试剂中，使细胞内的物质尽量接近于原始状态的形态结构和位置。组织细胞的固定（Fixati

6、on） 要求：完整性、天然性、抗原性、便于后期操作 策略：快速脱水、阻断酶活、保持抗原性 试剂：醛、醇、酮、酸 方法：浸泡法、灌流法、微波固定法抗原分类 不稳定抗原细胞表面标志 半稳定抗原B细胞表面IgG 较稳定抗原小分子蛋白，多肽类常用固定液 简单固定液福尔马林（4%甲醛）、乙醇（80-95%）、氯化汞（5-7%）、苦味酸（0.9-1.2%）、重铬酸钾（1-3%）、铬酸（0.5-1%）、锇酸（1-2%）、丙酮混合固定液中性甲醛、乙醇甲醛、4%多聚甲醛-磷酸缓冲液、 4%多聚甲醛-氢氧化钠、Carnoy液（冰醋酸、氯仿、乙醇）、Bouin液（苦味酸、甲醛、冰醋酸）、Zenker液（升汞、重铬酸

7、钾、蒸馏水、冰醋酸）、PLP（过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛）固定剂选择 血涂片：丙酮，福尔马林（胞质蛋白，BCR） 细胞涂片：95%乙醇、carbowax. 冰冻切片：乙醇、丙酮、多聚甲醛 石蜡切片：福尔马林（需抗原修复）、氯化汞（胞浆蛋白）PLP/PLDP（糖类、脂类）、乙醇、丙酮固定方法 浸泡法 蒸汽法 注射、灌注法 微波固定注意事项 固定液的量 固定的条件（温度、浓度、时间） 组织提取 组织块的体积 固定后的清洗组织的脱水 目的：去除组织中的水分，便于后期的有机溶剂处理。 方法：有机溶剂逐级吸收 试剂：乙醇、丙酮、正丁醇、叔丁醇、环己酮、松脂醇组织的透明 目的：便于浸蜡包埋 方法：逐级浸泡

8、 试剂：二甲苯、甲苯、氯仿、香柏油、苯甲酸甲酯、苯胺油浸蜡、包埋 一般光学显微镜观察的切片，用石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等作包埋剂； 电子显微镜则用环氧树脂、聚苯乙烯树脂、异丁烯树脂及水溶性树脂组织切片 载玻片处理 黏片剂明矾-明胶、多聚赖氨酸、树脂、甲醛-明胶等免疫组织化学技术基本流程一、样品的制备二、抗原抗体反应三、化学呈色反应四、免疫组织化学结果及其分析抗原抗体反应 抗原的暴露和修复 酶消化技术 热诱导修复技术 抗体孵育抗原修复 抗原修复缓冲液 0.01M TRIS-HCL Ph 1/10 胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶（细胞间抗原）、链霉蛋白酶、无花果蛋白酶热诱导修复 微波、灭菌锅、蒸汽、

9、压力锅、水浴 70-100度（10-60min） 注意事项： 自然冷却、避免蒸干、条件统一，结构改变，适当加入螯合剂免疫组织化学技术基本流程一、样品的制备二、抗原抗体反应三、化学呈色反应四、免疫组织化学结果及其分析染色策略ABC PROCEDURE UTILIZING CATALYZED SIGNAL AMPLIFICATION (CSA)biotinyl-tyramide显色系统 DAB显色液 AEC显色液（显色为红色） Hanker-yater试剂（蓝黑色） TMB显色液（脂溶性，显色为蓝色）显色效果的提高 蛋白酶消化 抗原修复 高敏感显色方法的使用放射免疫组织化学技术免疫荧光组织化学技术

10、免疫荧光组织化学技术免疫酶组织化学技术双标记或多重染色组化技术免疫电镜组化技术原位杂交技术膀胱癌和癌旁组织上用ADAM12 T3反义探针检测到阳性杂交信号(C,D)，而正义探针在癌旁的正常组织中只见到很弱或阴性信号(E,F)。D和F分别是C和D的黑视野图像。 免疫组化定量免疫组化技术免疫组织化学技术基本流程一、样品的制备二、抗原抗体反应三、化学呈色反应四、免疫组织化学结果及其分析 染色对照 表达特异性 阴性结果判断 出血、坏死、边缘部位的判定 综合评价染色结果四、免疫组织化学结果及其分析阳性对照阴性对照阴性组织阴性试剂（无关抗体、反向吸收、抑制试验）自身对照对照的设定非特异性染色 组织内源性干

11、扰 标记物干扰 抗体干扰 组织处理不当组织内源性干扰 自发和诱发荧光 胶原纤维和弹力纤维蓝绿色 软骨和角蛋白呈黄绿色 脂褐素呈棕黄色 甲醛固定后的肾上腺素，5羟色胺组织内源性干扰 内源性过氧化物酶 内源性生物素标记物干扰 荧光素（F/P2） HRP（RZ3） 亲和素（优先使用链霉亲和素）抗体干扰 抗体的非特异吸附 免疫原的交叉反应 IgG之间的交叉反应 天然抗体交叉反应组织处理不当 血清及分泌性抗原干扰 组织固定不及时 流程操作不规范非特异性荧光的消除 衬染法（伊文思蓝抑制自发荧光） 荧光抗体（纯化） 胰蛋白酶消化 吸收 血清孵育 双重标记 提高抗体质量非特异性染色的消除 抗体特异性不好：提高

12、免疫抗原纯度，组织吸收，采用单克隆抗体 连接抗体：提高二抗纯度 酶标抗体：避免Fc受体的结合，醛基的着色 DAB：含有杂质及沉淀 抗体浓度： 结缔组织假阴性结果 试剂缺少 二抗不匹配 抗体失效 抗体浓度过低 抗体干涸 抗原修复失败 酶处理时间太长 染色时间过短，酶活性小 叠氮化钠抑制HRP 显色液失效 显色缓冲液冲突 阳性对照错误阳性不强 固定不当 抗体反复冻融 抗体浓度过低 缓冲液残留过多 抗原修复不彻底 底物失效 显色时间过短，叠氮化钠干扰 缓冲液不匹配 复染、脱水、封片剂与显色系统的干扰 抗原表达少 染色过强 抗体浓度过高 显色时间过长 组织封闭效果不好 洗涤时间及次数不够 过氧化氢阻断不足切片上的杂质 洗涤不彻底 DAB析出 二甲苯不及时更换 固定时间过长 燃料沉淀抗原未按预期表达 封闭不当 一抗过高 二抗交叉反应 蛋白酶消化过度 抗原热修复过度弱假阳性 切片干涸 抗体过高 时间