江苏省职业暴露人群高致病性禽流感监测方案

1、江苏省职业暴露人群高致病性禽流感监测方案禽流感是禽类中由A型流感病毒株引起的一种急性传染病。在禽类中，禽流感可引起范围广泛的各种症状，包括从不宜查觉的疾病到可引起严重流行的快速致命性疾病。禽流感病毒通常不感染人类，但是也出现了特定高致病性毒株在人体中引起严重呼吸道疾病的情况。在多数病例中，感染者曾与受感染的禽类或被其粪便污染的物体有过密切接触。因此，有必要针对职业暴露人群及其环境开展监测，进一步监测感染来源，确定感染高危因素，监测禽流感病毒致病力和传播能力的改变，为制定科学的防控策略以及流感大流行预警提供科学依据。一、监测目的1、 了解职业暴露人群高致病性禽流感病毒（H5N1）感染状况。2、

2、了解高致病性禽流感病毒在环境中的分布情况。二、监测点设置全省13个省辖市均开展监测。各省辖市疾控中心根据地区特点，选择两类（或以上）下述场所作为监测点，记录监测点的基本信息，包括：整体环境，从业人员总体情况，禽类养殖、贩卖和屠宰等情况（规模、数量等），近期禽类免疫情况, 近期禽类发病情况，日常环境清洁和防护措施等，报省疾控中心备案。发生过动物和/或人禽流感疫情的地区，优先在疫情发生地或其周边设立监测点。监测场所包括：（1）城乡活禽市场；（2）家禽规模养殖场（户）；（3）家禽散养户集中的地区；（4）家禽屠宰加工厂；（5）野生候鸟栖息地。三、监测内容和方法（一）职业暴露人群血清流行病学监测1、监测

3、对象（1）活禽批发市场、城乡农贸市场或菜市场中直接与禽类接触的人员；（2）家禽规模养殖场（户）中直接与禽类接触的人员；（3）家禽屠宰加工厂中直接与禽类接触的人员；（4）家禽散养户的家庭成员；（5）野生候鸟栖息地中与候鸟或其排泄物有接触的人员；2、监测时间和监测数量各省辖市疾控中心每年冬春季（1-4月份）开展职业暴露人群血清流行病学监测，每年至少采集200 份血清标本。3、监测内容（1）流行病学调查收集调查对象的基本情况、禽类接触史等内容，填写“职业暴露人群血清流行病学监测调查问卷”（附表1），与血清标本同时寄送省疾控中心。（2）标本采集、运送采集监测对象的空腹静脉血5ml，填写“职业暴露人群血

4、清标本登记表”（见附表2）。分离血清，无菌条件下分装为3 份，其中1 份用于抗体检测，1 份留样保存，1 份（1ml）送省疾控中心复核。血清标本应置20或以下冻存，避免反复冻融。标本采集完成后2周内将标本及登记表送省疾控中心。标本运输时遵守国家生物安全的有关规定。（3）实验室检测各网络实验室应用单放射免疫扩散溶血实验（SRH）和/或马血球血凝抑制实验（HI）进行 H5N1 抗体检测；尚不具备检测能力和条件的实验室送省疾控中心检测（见附件2）。标本采集后要求1个月内完成检测工作，填写“职业暴露人群血清流行病学检测结果表”（见附表3），检测结束后1 周内将检测结果提交省疾控中心。（二）环境标本高致

5、病性禽流感病原学监测1、监测对象职业暴露人群血清流行病学监测点的水、禽类（含候鸟）粪便及笼具表面等环境标本。2、监测时间全年监测，每年的1、4、7、10 月各采集标本1 次。3、监测方法（1）标本采集各监测网络实验室至少每个季度采集标本1 次，每次采集各类标本至少20 份（应分布在不同场所），同时填写“环境标本采样登记表”（附表4）。标本采集种类及方法（见附件1）。（2）标本运输、处理标本采集后应在4条件下48 小时内运送至流感监测网络实验室。实验室收到标本后应立即进行标本处理（见附件1），并将标本分为3 份，1 份用于核酸检测，1 份留样保存，1 份备送省疾控中心复核。留样标本要求在70或以

6、下冻存。标本运输时遵守国家生物安全的有关规定。（3）实验室检测各网络实验室收到标本后1 周内对标本进行流感病毒A 和B 型核酸检测，A 型流感病毒核酸阳性标本进一步进行H5N1亚型检测，填写“环境标本病原学检测结果表”（附表5）。网络实验室每季度向省疾控中心提交“环境标本采样登记表”（附表4）和“环境标本病原学检测结果表”（附表5）。四、职责分工及组织实施（一）省疾病预防控制中心1、制定监测方案、实施监测工作，开展相关培训。2、定期对监测数据和结果进行分析，定期进行督导、考核及评估。（二）各监测网络实验室所在疾病预防控制中心1、负责辖区监测工作的实施，包括监测点的选择、监测人员的技术培训和指导

7、，数据收集整理及上报。2、对采集标本进行实验室检测，并及时向省疾控中心提交检测结果，按监测方案的要求及时上送各类标本。3、每年向省疾病预防控制中心提交年度监测工作总结。五、考核和评估省疾病预防控制中心组织对职业暴露人群高致病性禽流感监测工作进行年度考核、评估。考核内容包括：（1）疾病预防控制中心：实施方案的制定，监测工作的实施与管理等。（2）网络实验室：标本的收集、检测以及运送等。六、附表和附件附表1、职业暴露人群血清流行病学监测调查问卷附表2、职业暴露人群血清标本登记表附表3、职业暴露人群血清学检测结果表附表4、环境标本采样登记表附表5、环境标本病原学检测结果表附件1、标本的采集、处理、保存

8、与运输附件2、实验室操作方法简介江苏省疾控中心二一一年三月二十三日附表1、职业暴露人群血清流行病学监测调查问卷省市县编码 血清标本编号 一、一般情况1、姓名： （电话： ） 2、性别： 男性 女性3、年龄： 周岁4、现住址： 5、职业： 幼托儿童 散居儿童 学生（大中小学） 教师 保育员及保姆 餐饮食品业 商业服务 医务人员 工人民工农民牧民渔（船）民干部职员离退人员家务及待业其他 不详二、暴露情况（可多选）6、职业暴露人群种类：散养户 规模化养殖场从业人员 活禽批发市场人员 农贸市场或菜市场活禽交易人员 家禽屠宰加工厂人员 野生候鸟栖息地接触鸟类人员 其他 7、暴露方式：喂养 清扫禽舍 加工

9、（宰杀、拔毛、洗切、腌制、烹饪）食用 捕杀 运输 捕捉 销售 其他 8、如为养殖人员，禽类养殖方式：鸡 羽 1）散养 2）圈养鸭 羽 1）散养 2）圈养鹅 羽 1）散养 2）圈养鸽子 羽 1）散养 2）圈养其他 羽 1）散养 2）圈养9、近一个月来，接触禽种类：鸡 鸭 鹅 鸽子 野禽 其他 10、所接触的禽类是否接种过禽流感疫苗？ 是 否 不详11、近一个月以来，是否接触过病死禽？ 是 否 不详（如是，继续回答，如否或不详，跳至12题）（1）病死禽种类： 鸡 羽 鸭 羽 鹅 羽鸽子 羽 其他 羽（2）接触方式为： （可多选）喂养 清扫禽舍 加工（宰杀、拔毛、洗切、腌制、烹饪）食用 捕杀 运输

10、捕捉 其他 （3）接触病死禽时是否有防护措施？ 是 否 不详（否或不详跳至12题）如果有，采取的措施有： （可多选）戴口罩（N95 口罩、过滤口罩、棉纱口罩、一次性外科口罩） 戴面罩穿防护服（规范、不规范）防护眼镜 手套 帽子白大衣 其它 （4）接触病死禽的持续时间： 天（ 月 日到 月 日）累计暴露： 小时12、近1 个月是否出现过发热？ 是 否 不详（否或不详跳至13题）（1）发热起始时间 月 日，共持续 天，最高体温 （2）发热时是否伴有其它不适症状？ 是 否 不详（否或不详跳至13题）出现症状起始时间 月 日，共持续 天，主要症状有：头痛 咽痛 鼻塞 肌肉酸痛 腹痛 腹泻 其它 13、

11、近1 年是否接种过流感疫苗？ 是 否 不详调查人员单位： 调查人员： 调查日期： 审核人员： 审核日期： 附表2、职业暴露人群血清标本登记表采集地点 ： 县（市、区） 乡（镇） 标本编号姓名年龄性别现住址采样日期标本量备注注：1.采集地点：填写标本采集地的禽类场所名称2.标本编号原则：（1）血清标本代号 ：B （2）各市字母缩写（3）采集年份，如11年（4）实验室标本编号，从001开始 例：南京市疾控中心标本 BA11001，常州市疾控中心标本BC11001，宿迁市疾控中心BN11001采集人： 采集单位 ： 送检日期： 附表3、职业暴露人群血清流行病学检测结果表检测单位 ： 1.检测方法：马

12、血球HI SRH 2.使用抗原： 参考血清名称： 3 实验结果标本编号检测结果标本状态备注HI 滴度SRH 直径注：标本状态：溶血，乳糜血，黄疸，血清少检测者： 检测日期： 复核者： 附表4、环境标本采样登记表采集地点： 县（市、区） 乡（镇） 标本编号采集日期采集地点标本种类备注注：1. 标本编号原则：（1）血清标本代号 ：B （2）各市字母缩写（3）采集年份，如11年（4）实验室标本编号，从001开始 例：南京市疾控中心标本 BA11001，常州市疾控中心标本BC11001，宿迁市疾控中心BN11001采集人： 采样单位 ： 送检日期： 附表5、环境标本病原学检测结果表检测单位 ： 采用的

13、检测方法：One-step PCR： Real time PCR： 1. One-step 试剂盒2. Real-time 试剂盒：3. 引物来源：4检测结果标本编号采样日期检测结果备注ABH5N1其他阴性操作者： 检测日期： 复核者： 附件1、标本的采集、处理、保存与运输一、标本采集与处理1. 血清标本取真空负压采血管，做好标记，采集监测对象空腹静脉血5mL。然后置于室温数小时待血完全凝固。1500rpm2000rpm 离心10min，收集血清分装于3 支带外螺旋盖的冻存管中，做好标记。2. 环境标本环境标本采样液可使用Hanks 或Eagles 等培养液加入以下抗菌素和0.5%BSA：氨苄

14、青霉素 (2 x 106 IU/L)、 链霉素 (200 mg/L) 、多粘菌素 B (2 x 106IU/L) 、 庆大霉素 (250 mg/L) 、 制霉菌素 (0.5 x 106 IU/L) 、 盐酸氧氟沙星 (60 mg/L)、磺胺甲基异恶唑 (0.2 g/L)（1）水标本在禽类活动或笼具旁的水沟或水池的不同部位共收集水标本15-20ml 置于50ml 外螺旋盖的管内。水样标本到实验室后应在采样管中加入上述抗生素和0.5%BSA，再进行分装。呼吸道和环境标本要在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液和固体，置4待其自然沉淀510min，取上液分装。分装好留1份进行核酸检测。（2）笼

15、具表面标本用沾有采样液的带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭笼具表面3-5 个不同部位，然后将擦拭过的拭子放入含5ml 采样液的采样管中，尾部弃去。二、标本保存和运输1血清标本保存可置4存放3 天，存放超过3 天需置-20或以下保存。2. 标本运输标本放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同时寄送标本登记表。异地运输可以采用邮寄或快递的方法，运输要求符合国家生物安全有关规定。病原学标本按B 类感染性物质进行运输，航空采用UN3373 包装。（三）标本报告和联系方式联系地址：南京市鼓楼区江苏路172号联系电话： 02583759529, 025-837

16、59404传真： 02583759409结果提交邮箱：huox附件2、实验室操作方法简介一、马红细胞血凝抑制试验检测禽流感抗体（一）生物安全要求禽流感H5N1 亚型检测抗原的灭活需要在BSL-3 级实验室进行。其余操作均在BSL-2 级实验室进行。（二）材料1抗原：灭活的H5N1 流感病毒。2血清：（1）阳性对照血清；阴性对照血清（2）待检血清3其他主要试剂：（1）马红细胞（1:1 的比例保存于阿氏液中，建议采血后72 小时内使用）（2）磷酸盐缓冲液（PH 7.2 PBS）：0.01M；（3）牛血清白蛋白（BSA）；（4）霍乱滤液（RDE）4其他：（1）“V” 型96 孔微量板（2）37及56

17、水浴锅（3）台式离心机（4）多道可调加样器（5）离心管（三）质量控制1、对照血清每块96 孔板上均需要设立阳性对照和阴性对照，同批次的阳性对照结果滴度应保持2 倍以内。2、红细胞对照实验可根据红细胞对照来判断反应时间，尽可能在每块96 孔板上设计一孔红细胞对照（PBS+1%红细胞悬液）。3、病毒回滴一个红细胞凝集单位指能引起等量标准化的红细胞凝集时病毒的量。进行红细胞凝集抑制试验时一般用4 个红细胞凝集单位（指25L 体积中含有4 个红细胞凝集单位）的病毒量。（四）实验步骤1血清处理（1）用单道加样器吸出1 体积血清置于无菌Eppendorf 管内，换滴头加入4体积RDE，吹打混匀。（2）置3

18、7水浴1618h。（3）从37水浴取出后置56水浴30min 灭活。（4）马红细胞吸附：瞬时离心，待冷却后加入清洗后的浓红细胞达20%（每100LRDE 处理过的血清加入20L 清洗后的浓红细胞）。混匀后室温吸附1 h。（5）2000rpm 离心5min。（6）小心吸取上清液至干净离心管中备用。如不需立即检测可放4保存。2马红细胞的采集及1%马红细胞悬液的配备（1）在注射器里放入一定体积的阿氏液，从颈静脉处采集马血后放入容器中，轻柔混匀，如阿氏液不足则需补足（阿氏液和红细胞的比例为1:1）。（2）采集的马红细胞应放入冰箱4保存，越新鲜越好，建议在采集后72小时内使用。（3）在配置1%马红细胞悬

19、液前需清洗红细胞液。首先加入5mL 红细胞（沉积在容器底部的红细胞）至50mL 离心管。加入45mL PBS-0.5% BSA 使总体积达到50mL，轻柔混匀。（4）2000rpm(600g) 离心5 min。（5）吸掉上清液后，连续重复步骤（3）-（4）两次。（6）为了精准马血球的浓度，取浓缩后的马血球1ml 于1.5ml 离心管中，3600g（8000rpm）离心10min，吸取压缩后血球的上清并统计出吸取上清的体积，计算实际的血球百分比（一般达到未压缩前体积的60-75%）。将完全压缩后的马血球弃去。（7）计算最终的血球量使浓度达到完全压缩后的1%，取所需洗好马血球的体积加入PBS-0.

20、5% BSA 中，每次用前轻轻混匀后使用。3. 制备用于红细胞凝集抑制试验的4 个红细胞凝集单位的抗原（1）将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1H1 称为第一列；平行方向称行，如A1A12 称为A 行。标记好标准诊断抗原及加样顺序。1）吸取50L PBS 加入微量板的第二列至最后一列，于第一列加入100L标准诊断病毒。2）从第一列取50L 病毒液，依次从第二列至第八列做2 倍系列稀释。最后一列每孔弃去50L 稀释后的病毒液。3）每孔加入50L 1%的红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。4）室温孵育4560min，观察红细胞凝集现象并记录结果。5）结果判定：红细胞凝集滴度的判定以

21、出现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的红细胞凝集滴度。红细胞完全凝集以“+”记录；无凝集或部分凝集“-”记录。（2）制备4 个红细胞凝集抗原时：首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。如每份血清作8 孔稀释，每孔用抗原25L 抗原，那么测定一份血清需0.2mL 抗原。根据参比血清的份数计算出实验所需病毒抗原量，然后配制抗原。（3）计算出病毒稀释度。用病毒红细胞凝集滴度（HA 滴度）除以8，得到的商即为4 个红细胞凝集单位的稀释度。如，某病毒的HA 滴度为64，除以8 等于8。按1:8（1mL 病毒液加7mL PBS）稀释该病毒即可得到4 个凝集单位/25L的抗原病毒

22、量。（4）为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误，新配制的4 个凝集单位抗原须复核滴定：取50L 稀释好的抗原，用等量PBS 做倍比稀释（同病毒滴定）后加入50L 红细胞悬液，至室温孵育4560min 后观察凝集结果。如只有前4 孔出现凝集，表明每50L 病毒含有8 个凝集单位（即25L中含有4 个红细胞凝集），该病毒稀释准确，可以用于红细胞凝集抑制试验。如第5 孔也出现凝集，说明每50L 病毒含有16 个凝集单位，该抗原必须等量稀释。如只有前3 孔凝集，表明每50L 病毒仅含有4 个凝集单位，病毒量需要加倍。此外，4 个凝集单位抗原必须每次用前新配制。4红细胞凝集抑制试验（HI

23、）检测血清抗体将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1H1 称为第一列；平行方向称行，如A1A12 称为A 行。标记好待检病毒的实验室编号及加样顺序。（1）每孔加入25L PBS。（2）A1 加入25L 标准诊断血清作为阳性对照；A2 加入25L H5N1 阴性血清作为阴性对照。（3）自A3 孔开始分别加入25L 待检血清；（4）用多道加样器吸取25L 血清（A1-A12），由A 行至H 行做2 倍系列稀释血清，至H 行后弃去25L。系列稀释时需注意每一次稀释都应混合均匀。（5）加入25L 含4 个凝集单位的抗原。（6）混匀后室温孵育30min。（7）每孔加入50L 1%马红细胞悬液，轻弹微量

24、板，使红细胞与病毒充分混合。（8）室温孵育45-60min，观察红细胞凝集抑制试验结果。（9）结果判定当特定的抗体与相应的红细胞凝集抗原结合后，可以抑制病毒引起的红细胞凝集现象。红细胞凝集抑制效价是指抑制红细胞凝集出现时血清的最高稀释度的倒数。如1:80 稀释的血清孔不出现凝剂（红细胞凝集完全抑制），1:160 稀释的血清孔出现凝集（无红细胞凝集抑制），该血清对测定病毒的红细胞凝集抑制效价为80。人血清对H5N1 抗原的抑制效价1:160 可判定为阳性（参考WHO 推荐标准），但还需要用另一种血清学方法验证。二、流感/禽流感单放射免疫扩散溶血技术抗体检测（一）生物安全要求抗原的制备和血清灭活根

25、据所从事病毒的种类在相应的生物安全级别实验室进行，SRH 检测在生物安全二级（BSL-2）实验室进行操作。（二）材料1Alsevers 液2pH 7.2 PBS 缓冲液310%叠氮钠（sodium azide， NaN3）溶液4510-4mol/L KIO4（过碘酸钾）溶液11.5 mg KIO4 加入pH7.2 PBS 溶液至100mL，完全溶解后置4保存。51%琼脂糖61%鸡红细胞悬液7浓鸡红细胞（洗涤后去掉上清的鸡红细胞）8补体的制备至少6 只健康成年豚鼠，采血前一天下午禁食，第二天上午从心脏采血，每只可采510mL，每只采完后速至冰上，多只豚鼠血清混匀后使用，当天分离血清，分装，置-7

26、0冰箱中保存。由于补体耐热性差，因此，操作时尽量在4条件下进行。9抗原一般采用接种鸡胚尿囊腔后收获的流感/禽流感病毒液，甲醛灭活的病毒需在-70中保存，并且注意避免反复冻融。10参比血清抗H5N1病毒兔血清及普通流感病毒参比兔血清。11测定血清血清检测前56 30min灭活去除血清中不耐热的非特异性抑制素和补体；血清从56水浴箱中取出，置室温冷却，每管加终浓度为20%的浓鸡红细胞，混匀，置室温1h 或4过夜，1500rpm 离心10min，弃沉淀物，留上清。红细胞吸附的目的是去除人血清中可能含有对鸡红细胞的嗜异性抗体（Forssmans antibody）。12免疫扩散板13打孔器，孔径为2m

27、m 和3mm 的打孔器。14小烧杯，带盖的可装扩散板的塑料盒。15测量放大镜（带有每个刻度0.1mm 的刻度尺）或一般透明并带刻度的尺子。根据测量的溶血圈直径，可按下列公式计算出溶血圈面积（S）：S1=R12 S2=R22 S=S1-S2如用3mm孔径，测量的溶血圈直径为8mm，代入上述公式就可算出溶血圈面积：S1=R12 = 42=3.141616=50.27（mm2）S2=R22=1.52=3.14162.25= 7.07（mm2）S=S1-S2=50.27-7.07=43.20 （mm2）（三）实验步骤1、病毒抗原红细胞凝集滴度的测定及1000 个红细胞凝集单位计算（1）病毒抗原红细胞凝

28、集滴度的测定采用鸡血球，按常规流感病毒96 孔微孔板进行病毒滴度测定。（2）1000 个红细胞凝集单位计算根据红细胞凝集滴度算出1000 个红细胞凝集单位所需测定病毒的量。如病毒滴定时红细胞凝集滴度为64，则按下列公式计算：0.05:64=x:1000, x =（0.051000）/64=50/64=0.78（mL）也就是说，每0.1mL浓的鸡红细胞中需要加入0.78mL测定的病毒溶液。按这个比例算出实验所需的病毒量。2溶解1%琼脂糖并恒温于60水浴箱中。使用PH7.2 的PBS 同时加入1NaN3 以防止细菌生长。煮沸或者用微波炉使1%琼脂糖完全溶解，速置60水浴箱中，分装于小烧杯中，2.9

29、mL/杯，置60水浴箱中。根据工作量计算出所需烧杯的数量。3红细胞处理按每块扩散板需50l 浓的鸡红细胞，计算出工作中所需的浓红细胞容量，将所需的浓鸡红细胞放入带尖底的15mL离心管中，加入等容量的510-4 mol/L KIO4，混匀，置室温15min。 KIO4处理的目的是使病毒吸附到红细胞表面后不会游离下来。4加病毒抗原按每0.1mL 浓鸡红细胞需1000个红细胞凝集单位病毒抗原的比例，加入KIO4处理过的红细胞，混之，置室温10min，1500rpm离心3min，弃上清，用至少5倍量于沉淀物的pH7.2 PBS冲洗，1500rpm离心10min，弃上清，加入与红细胞等量的pH7.2 的

30、PBS。5把所需的扩散板平排好，并标明标记。6溶血板制备用吸管将步骤中红细胞轻轻吹匀，而后吸出100L放入恒温在60水浴箱中含2.9mL琼脂糖的烧杯，置水浴中摇匀，而后迅速倒入扩散板中，并迅速用烧杯铺平之。待第一块板铺完后，按同法铺第二块板，直至全铺完。溶血板凝固后应为红细胞均匀分布的透明凝胶板，若出现芝麻样颗粒、浓淡不均的血丝等，均应重新进行铺板。7打孔待琼脂糖完全凝固（一般置室温1520min）后打孔，诊断用打3mm直径孔，血清流行病学调查打2mm直径孔。打完后用针头将孔中琼脂挑出，然后盖上板盖。8加样孔径3mm的一般10L/孔，孔径2mm的为45L/孔，每批实验必须要有阳性和阴性血清对照

31、；配对血清应在同一板上进行，以便减少板间的误差。9扩散当每块板加完样本，马上盖上板盖。待全部板加完样本并盖上板盖，平放在带有湿度的盒子中，置4冰箱扩散1618h。10加补体补体从-70冰箱取出，用自来水龙头冲之，让其速溶。溶后速置冰上，用冷的pH 7.2 PBS进行1:3或1:4稀释，即1mL补体稀释成3mL或4mL。将扩散板从冰箱取出，平放实验桌上，每板平铺稀释好的补体1mL，平放带有湿度的盒中，无需板盖，平放3537 孵箱4h。正常红细胞对照板，除病毒用pH7.2 PBS替代外，其余操作步骤完全与实验板相同。11结果观察和判断4 h以后，从孵箱中取出，倒掉补体，进行结果观察。（1）阳性对照

32、血清应出现清晰，而不是模糊或不透明的溶血圈，并溶血圈面积比预实验的不能相差1.5 倍或以上；阴性对照血清不应出现任何溶血圈。（2）正常红细胞对照板不应出现任何溶血圈。（3）恢复期血清溶血圈面积应为急性期的2 倍表示有意义的差异；两者相差1.5 倍为实验误差；两者相差1.5 倍或以上但不到2 倍，需重复测定，如仍相差1.5 倍或以上但不到2 倍，可判为有意义差异。如重复测定相差为1.5倍，表示为实验误差。不配对血清测定时，2mm孔径的，溶血圈直径需4mm（溶血圈面积9.42mm2）；3mm孔径的，溶血圈直径需5mm（溶血圈面积12.57mm2）可认为是阳性血清。12注意事项（1）抗原量一定要掌握

33、准确，量过大一方面使测定敏感性下降，另一方面由于过量的病毒颗粒吸附在红细胞表面，红细胞不易吹散开，铺板时易出现芝麻样颗粒，过少的红细胞溶解不清晰或不溶解。（2）血清尽量避免反复冻融，因反复冻融会产生抗补体影响溶血圈的清晰度。（3）双份配对的血清应在同一块板上进行测定，以便避免板间的误差。（4）阳性对照血清，有时由于滴度过高，出现很大的溶血圈，把邻近的孔覆盖，因此，最好靠近它的孔不加样本或将阳性血清进行适当稀释，如1:5 稀释，而后使用之。（5）对患者进行血清学诊断时，建议用3mm 孔径的孔，因用2mm 孔径有时会出现重叠溶血圈影响结果准确的判断。进行血清流行病学调查时建议用2mm 孔径。（6）

34、测量溶血圈直径时，应测量最清晰的，因标准的溶血圈常为靠近孔边缘出现清晰透亮的溶血圈，它的外围出现不十分清晰的溶血圈，此溶血圈外围又有个清晰的溶血圈，这是要测量的直径。测量时，尺子要挨在扩散板上。（7）正常红细胞对照板所出现的溶血圈面积与实验板几乎一样大小，表明嗜异性抗体未完全去除干净，应再用鸡红细胞进行再吸附来去除之；如对照板所出现的溶血圈面积比实验板小2 倍或以上，一般不影响对实验结果的判断。（8）琼脂糖最好用高纯度，低熔点，在有效期内，新鲜配制的，配好后保存期不超过一个月，因保存期过长，铺板时易造成琼脂板出现裂缝。（9）一定要加1NaN3 以防止细菌生长，因细菌会造成非特异性溶血。（10）

35、温度一定要控制好，因补体不耐热，操作补体时间尽量要缩短，并在4下操作；补体一定为6 只豚鼠的混合血清。（11）禽类血清不结合豚鼠补体，不应用鸡的抗血清作为阳性对照血清。（12）如缺乏时间对实验结果进行观察和测量，可将实验板置4冰箱，至少一星期进行测量不影响实验结果；溶血板制备完后，平放带湿度的盒中，置4冰箱，最长只能存两星期。三、A 型流感病毒RT-PCR 检测（一）生物安全要求分装标本、裂解病毒需在BSL-2 级实验室生物安全柜内操作。核酸检测区域要分出试剂配制、核酸提取、扩增、检测的不同分区。（二）主要材料1提RNA Kit：QIAGEN RNeasy Mini Kit （catalog

36、#74104）2巯基乙醇（SIGMA -Mercaptoethanol Lot 062K0115）370乙醇4RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212）5Promega RNasin Ribonuclease Inhibitor （catalog #N2111）6检测引物：Forword and Reverse Primers（均为10M），序列如下：类型序列甲型通用FluA-M-F305- TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG -3FluA-M-R2645- ACA AAG CGT CTA CGC TGC AG

37、 -3（三）实验步骤1RNA 提取（1）根据标本数量分装RLT 液：从Kit 中取出RLT 液，用1.5mL 离心管分装，每管500L（在体系配制区操作）。（2）加标本100ul 到裂解液中。（3）每管分别加入5L -巯基乙醇，混匀后依次加入600L 70%的乙醇，充分混匀。（4）从Kit 中取出带滤柱的2mL 收集管，打开包装将其做好标记。取步骤2中的混合液600L 加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。（5）滤柱仍放回收集管上，将步骤2 剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。（6）于滤柱中加入700L Wash Buffer RW1 液

38、，12000rpm，离心15s。（7）从QIAGEN RNeasy Mini Kit 中取一支干净的2mL 收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500L Wash Buffer RPE 液，12000rpm，离心15s。（8）弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500L Wash Buffer RPE 液，1300014000rpm，离心2min。（9）将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf 管上，向滤柱中加入3050L的Rnase-free Water，室温静置13min。（10）12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20以下

39、保存。注意：Buffer RPE 使用之前加无水乙醇。2反应体系配制（1）实验设计：检测标本RNA 时，阴性对照用无菌水，阳性对照用已知病毒RNA。（2）PCR 反应体系配制（在体系配制区配反应液）2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR 小管中，每管20L，分别做好标记。3）加RNA 模板（在核酸提取区）将上述分装好的PCR 小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5L 无菌水），然后分别加标本RNA（每管5L），最后加入阳性对照RNA（每管5L）。（3）RT-PCR将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR 仪进行RT-PCR扩增，反应程序如下：1）60作用1min， 2）42作

40、用10min， 3）50作用30min4）95作用15min， 5）94变性30s， 6）50退火30s，7）72延伸1min，回到第5 步，34 个循环， 8）72作用10min，9）4 保存（4）RT-PCR 产物检测：1）将制备好的1.5琼脂糖凝胶入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1TBE）浸过胶面即可。2）PCR 产物各取10L，加入2L 上样缓冲液（6Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内先加Marker（DL2000）5L，然后依次加标本PCR 产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。3）观察结果并用凝胶成像系统拍照记录。（四）结果判断：在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，判断结果，阳性各条带为：甲型（210bp）出现特异性条带，判为阳性结果。未出现条带，或不在上述位置出现非特异性条带，均判为阴性结果。四、A型流感病毒实时荧光定量PCR检测实时荧光定量（Real-time）RT-PCR 技术，是指在RT-PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR 进程，最后