曲霉菌检测技术要点及Troubleshooting

1、曲霉菌抗原检测试剂盒曲霉菌抗原检测试剂盒技术要点技术要点郭芳岑产品经理伯乐生命医学产品（上海）有限公司2曲霉菌抗原检测试剂盒曲霉菌抗原检测试剂盒基本技术介绍基本技术介绍3曲霉菌抗原检测试剂盒曲霉菌抗原检测试剂盒包装规格包装规格：96T/Kit 试剂试剂盒组成盒组成：微孔板、 浓缩清洗液、 阴性对照血清、 cut-off质控血清、 阳性对照血清、 酶标结合物、 样本处理液、 TMB溶液、 终止液、 微板密封板、 说明书等。 4曲霉菌试剂盒基本原理曲霉菌试剂盒基本原理 目的目的 采用酶联免疫双抗体夹心一步法（酶联免疫双抗体夹心一步法（ELISAELISA）半定量检测人血清血清样本中半乳甘露聚糖抗原

2、，用于对侵袭性曲霉菌感染高危患者的筛查诊筛查诊断，动态疗效监测及临床用药的评估断，动态疗效监测及临床用药的评估 原理 采用双抗体夹心ELISA方法检测血清样本中的半乳甘露聚糖抗原。微板中包被半乳甘露聚糖抗体，可与样本中半乳甘露聚糖抗原和试剂中酶标抗体试剂结合形成抗体抗体- -抗原抗原- -酶标抗体复合物酶标抗体复合物，然后加入TMB底物产生显色反应。通过酶标仪检测吸光度（OD值），经公式计算得到I值（GM指数），根据GMI与cut-off值（0.5）的比较判断有无曲霉菌的感染或感染的程度 5所需仪器或材料所需仪器或材料（1） 实验室台式离心机：1.5mL聚丙烯试管，能获得10,000g的离心加

3、速度（2） 加热块，或水浴设备（温度为100 ）（3） 微孔板孵育器371 （4） 全自动或半自动微孔板洗板机 （5） 备有450nm和620/630nm滤光片的酶标仪6曲霉菌操作流程曲霉菌操作流程1.处理对照血清和患者样本（血清/BAL）:300ul +100ul R72. 扣紧试管盖，120加热6分钟（heater）3. 扣紧试管盖，100加热3分钟（水浴）4. 10,000g 离心10分钟7曲霉菌操作流程曲霉菌操作流程4.准备记录表，以区分对照和患者得到样本（不同微孔）5. 每孔加入50ul R6（酶结合物）6. 每孔加入50ul处理好的样本上清（对照或患者）7. 用封板膜将96孔板封好

4、后，置于37孵育90分分钟钟8曲霉菌操作流程曲霉菌操作流程8.准备洗液：将稀释液R2按照1:20比例用去离子水稀释 9. 用洗液抽吸抽吸洗涤5次10. 每孔快速快速加入200ul显色剂TMB溶液（R9），注意避光注意避光11. 室温（18-25）避光，孵育避光，孵育30分分钟钟（不封膜）9曲霉菌操作流程曲霉菌操作流程12.每孔加入100ul终止液（R10），小心擦拭96孔板底部13. 在450/620nm波长下读取OD值。加入终止液后需在30分分钟钟内内完成读数14. 样本中GM抗原的结果通过计算GMI（GM指数）确定：GMI=样样本本ODCut-off对对照均照均值值（ （R4 OD） ）G

5、MI0.5 阳性阳性10样本记录表样本记录表Step 4Step 4 准备一份可以识别微孔板上受检血清和对照血清的图表。用其中一孔作为阴性对照血清使用（R3），两孔作为Cut-off对照血清（R4），一孔用于阳性对照血清（R5）。 R31.511临床临床GMGM检测流程检测流程12曲霉菌抗原检测试剂盒曲霉菌抗原检测试剂盒操作注意事项及技术要点操作注意事项及技术要点13实验室工作流程实验室工作流程患者准备样本采集样本保存、运输样本检测报告签发报告应用14如何保证检测质量？如何保证检测质量？人机料法环15曲霉菌的特点曲霉菌的特点 霉菌的分布 占空气中真菌的12%来源于百度百科 空气中真菌前三甲：

6、Cladosporium：37% Non-sporing：22.5% Yeast：18.3% 灰尘中真菌前三甲：Yeast：50.6%Cladosporium：17%Aspergillus:12%Aspergillus:12%来源于现代医药卫生2007年第23卷第9期1409 最适宜生长温度25-3016曲霉菌的检测首要重视环境问题曲霉菌的检测首要重视环境问题以下工作应在超净台内完成： 试剂盒和耗材拆包装及密封 样本取样并加处理液17实验前准备实验前准备 打开超净台 75%酒精擦拭洁净台桌面及内壁 紫外灯消毒15分钟以上，操作前关闭紫外灯 记号笔（防水） 离心管架 加样槽18实验操作步骤及注意

7、要点实验操作步骤及注意要点在使用前，将试剂从冰箱冷藏室取出平衡平衡3030分钟至室温分钟至室温后方可使用 19样本处理样本处理 超净台内操作 洁净的耗材 加样枪的正确操作20做好标记，防止结果无法对应做好标记，防止结果无法对应21耗材的洁净要求耗材的洁净要求 无热原 消毒无热原 无尘 超净台内开包装 超净台内密封后移出22正确使用加样枪正确使用加样枪 定期校准 垂直操作 枪头要卡紧 慢吸快打 吸一档打二档或吸一档加样后反复吹打 不建议吸二档打一档 枪头不要再次使用23加热加热 注意孵育时间和温度 猜我喜欢哪个？24Heat BlockHeat Block的一点小问题的一点小问题25对小离心管的

8、要求对小离心管的要求 不要太紧 不要太松 无尘无热原26离心离心 离心时“配平”是基本常识 注意转速和时间 注意换算 公式：G=1.1110-5Rrpm2 G：离心力 R：离心半径（单位：厘米） rpm：转速 例： 如离心机为10cm离心半径，则Rpm应为9492 如离心机为15cm离心半径，则Rpm应为632827样本布局样本布局 注意加样位置 理解ELISA实验的“边缘效应”28加酶结合物加酶结合物 排枪不如你想象那么好用 使用前做好检查 使用要点同单枪 排枪使用需要加样槽 加样槽要洁净，每次用后要及时清洗。29加样加样 注意节奏 你会质疑自己是不是“老花眼”30孵育孵育 孵育时要盖密封条

9、 震荡混匀要小心 拆掉密封条要小心31配制洗液配制洗液 注意配制比例 纯水要使用新鲜制取 不要舍不得用R2 要冲洗管路 管路会有残留 瓶子会有挂壁32洗板洗板 不要过于相信机器 管路是否洁净 加样是否都加满 吸样是否都吸尽 我的习惯 最后一次吸样结束后拍一拍 不要挑战“拍力”的极限33加显色剂加显色剂 注意这个词：Rapidly 回顾一下： 排枪使用加样槽 注意：绝对不要同加酶结合物的加样槽混用。 如果实在要用，要确保酶结合物不会混进TMB溶液中。34显色孵育显色孵育 不覆盖封板膜 温度要求：室温 最重要的一点： 避光35终止终止 注意按照TMB的加样顺序 尽量保持同TMB加样的节奏36读数读

10、数 注意在终止后3030分钟内分钟内读数 双波长（ 450/620nm ）读数 读数前用吸水纸擦干酶联板底部 如果对读数有疑问，可以用白纸铺底看小孔内的颜色 读数值越高，则颜色越黄 如果孔内为蓝色，需要补加终止液 隐约可见蓝色，可能是终止液加入未混匀。37结果结果 准确的结果：准确的结果：优质的试剂正确的操作良好的仪器38曲霉菌抗原检测试剂盒曲霉菌抗原检测试剂盒Trouble shootingTrouble shooting39问题问题可能的原因可能的原因解决方案解决方案对照血清值太高对照血清被污染 确保 R3, R4 和 R5对照血清没有混淆 避免环境中曲霉菌的污染，在洁净环境中使用对照血清

11、 确保没有重复使用枪头前期处理不当 确保前期处理是使用300ul对照血清和100ul的处理液（R7）进行的 试剂用量错误 加样枪是否是否调到正确的刻度（是否定期维护） 用正确的试剂量重新检测曲霉菌抗原检测试剂盒曲霉菌抗原检测试剂盒- -Troubleshooting Guide40问题问题可能的原因可能的原因解决方案解决方案对照血清值太高加入了过量的处理后的对照上清 确保加入了50 l 处理后的对照上清处理后的样本上清加入过早，在酶结合物之前加入（R6之前） 每孔先加入50 l 酶结合物(R6) ，再加入对照上清第一次孵育时没有密封好 紧压微孔板密封膜以确保密封好孵育温度不对 确保样本与R6的

12、孵育温度为37 +/- 1C:加热块的选择确保没有超过最大容纳量确保温度没有反复波动加热块的维护是否定期曲霉菌抗原检测试剂盒曲霉菌抗原检测试剂盒- -Troubleshooting Guide41问题问题可能的原因可能的原因解决方案解决方案对照血清值太高孵育温度不对 确保显示底物的孵育温度为 18-25C:- 当时的室温是多少？- 是否开了空调？最后孵育步骤操作不当 不封膜 避光 18-25 C 孵育过度 确保孵育温度和时间严格依照说明书洗涤不够 手工还是自动洗板？ 洗板机是否正常维护？运行是否正常？ 确保洗涤后将微孔板彻底吸干 避免洗板过程中的污染曲霉菌抗原检测试剂盒曲霉菌抗原检测试剂盒-

13、-Troubleshooting Guide42问题问题可能的原因可能的原因解决方案解决方案对照血清值太高洗涤不够洗涤了几次洗液用量是多少？洗板机是否洗的彻底？没用去离子水稀释洗液 确保使用去离子水稀释洗液 如果用洗板机，确保正确注入洗液洗液稀释比例不对 按照说明书要求比例进行稀释显色液 TMB被污染或染色 弃掉污染的R9并使用新的 不要把剩余的显色液重新倒回试剂瓶曲霉菌抗原检测试剂盒曲霉菌抗原检测试剂盒- -Troubleshooting Guide43问题问题可能的原因可能的原因解决方案解决方案对照血清值太高终止液被污染 丢弃污染的终止液并更换新的 不要把剩余的终止液倒回试剂瓶 避免终止液

14、接触金属物品读板：酶标仪使用不当 使用的酶标仪程序是否正确设置 选择450 nm 滤光器和 620 或630 nm 参考滤光器 加入终止液后30分钟内读完.试剂存储温度或使用温度不当 所有试剂从冷藏室置于室温(18-25C) 30 分钟后方可使用 存储试剂在2 - 8C. 试剂使用前需完全混匀曲霉菌抗原检测试剂盒曲霉菌抗原检测试剂盒- -Troubleshooting Guide44问题问题可能的原因可能的原因解决方案解决方案阳性对照值偏低试剂过期或储存不当 使用效期内的产品 . 微孔板开封后可保存8周，需用干燥剂且密封储存 工作洗液可在2 - 30C保存14天使用前未放置室温平衡 所有试剂从

15、冷藏室置于室温(18-25C) 30 分钟后方可使用 试剂使用前需完全混匀阳性血清加入量错误，或者未加入 确保吸入正确的血清以及剂量 加样抢是否校准 确保将阳性血清加入正确的微孔血清前处理不当 确保血清处理步骤和温度严格遵守说明书曲霉菌抗原检测试剂盒曲霉菌抗原检测试剂盒- -Troubleshooting Guide45问题问题可能的原因可能的原因解决方案解决方案阳性对照值偏低孵育温度不对 确保与酶结合物的孵育是在37 1C. 确保与显色剂的孵育温度为18-25C. 确保加热块温度没有过高 确保加热块温度没有反复波动洗液过度稀释或使用不当 1份浓缩洗液与19份去离子水或蒸馏水配比 确保洗板机预

16、先装入了洗液重复使用试剂槽或试剂槽被污染 保证试剂槽是一次性使用 未使用的剩余试剂不能倒回试剂瓶中用聚苯乙烯容器装显色液TMB 使用聚丙烯容器装显色液TMB曲霉菌抗原检测试剂盒曲霉菌抗原检测试剂盒- -Troubleshooting Guide46问题问题可能的原因可能的原因解决方案解决方案阳性对照值偏低显色液TMB污染 丢弃污染的显色液并更换新的 确保使用正确剂量 显色孵育不够或不当 避光孵育30 5 分钟 不要使用密封膜 终止液加入不当或读数不当 加入终止液后30分钟内读数 使用450nm和620/630 nm 参照滤光器. 在加入前确保终止液完全混匀曲霉菌抗原检测试剂盒曲霉菌抗原检测试剂

17、盒- -Troubleshooting Guide47问题问题可能的原因可能的原因解决方案解决方案OD 值低于0.000酶标仪波长设置错误 设置酶标仪波长在 450 nm 和620 to 630 nm 参比滤光器酶标仪参数设置错误 确保酶标仪参数设置正确 滤光器脏污或松动 检查、清洁或更换滤光器未加入样本或试剂 确保正确加入了样本或试剂终止液加入或混匀不当 加入终止液后轻怕微孔板，确保与反应体系混匀 检查加样抢的重复性，必要时校准 曲霉菌抗原检测试剂盒曲霉菌抗原检测试剂盒- -Troubleshooting Guide48问题问题可能的原因可能的原因解决方案解决方案第二次孵育后没有颜色未加入处

18、理后的样本或对照上清 确保加入未加入酶结合物 确保加入未加入显色剂TMB溶液 确保加入工作液(R2) 配制不当 依照说明书正确配制曲霉菌抗原检测试剂盒曲霉菌抗原检测试剂盒- -Troubleshooting Guide49问题问题可能的原因可能的原因解决方案解决方案阳性样本不能重复重复检测时所选样本错误（不是该阳性样本） 确保样本选择正确初次检测可能受阳性样本污染 小心处理阳性样本避免污染检测样本样本之间出现交叉污染 确保微孔中的内容物没有飞溅 确保密封膜没被使用过 小心揭开密封膜避免微孔中内容物溅出 洗板时确保微孔中内容物无溢出曲霉菌抗原检测试剂盒曲霉菌抗原检测试剂盒- -Troubleshooting Guide50问题问题可能的原因可能的原因解决方案解决方案阳性样本不能重复加样枪或枪头污染 清洁加样枪 保证枪头一次性使用 避免加样抢被阳性样本污染 残留结合物或样本