生物制品实用教案

1、 一、生物制品概述 二、疫苗研究及其研制策略 三、生物制品的一般制造(zhzo)方法、质量要求 与检定 四、重要生物制品的制备 五、核酸疫苗第1页/共120页第一页，共120页。第一节：生物制品(shn w zh pn)概述 1 概念及发展沿革 2 生物制品的分类(fn li) 3 制造生物制品的生物学及免疫学基础第2页/共120页第二页，共120页。1 概念(ginin)及发展沿革 1.1 概念 凡是从微生物及其代谢产物、原虫、动物毒素、人或动物的血液或组织直接加工制成，或用现代生物技术、化学方法制成，作为预防、治疗、诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂。 包括各种( zhn)疫苗、抗血清

2、、抗毒素、类毒素、免疫调节剂、诊断试剂等。第3页/共120页第三页，共120页。1.2 从疫苗生产(shngchn)看生物制品的发展 12世纪，中国开始用人痘接种预防天花，从症状轻微的天花病人身上人工接染到健康儿童，使其通过产生轻微症状的感染获得免疫力，避免天花引起的严重疾病甚至死亡。 1721年，人痘接种法传入(chun r)英国，英国医生琴纳注意到感染过牛痘的人不会再感染天花。经过多次实验，琴纳于1796年从一挤奶女工感染的痘疱中，取出疱浆，接种于8岁男孩的手臂上，然后让其接种天花脓疱液，结果该男孩并未染上天花，证明其对天花确实具有了免疫力。 最早的弱毒活病毒疫苗。第4页/共120页第四页

3、，共120页。1.2 从疫苗生产看生物制品(shn w zh pn)的发展 1798年，医学界正式承认“疫苗接种确实是一种行之有效的免疫方法”。 经过一百多年的努力，1980年世界卫生组织宣布全球消灭了天花。 1870年，法国(f u)科学家巴斯德发明了第一个细菌减毒活疫苗鸡霍乱疫苗。巴斯德将此归纳为对动物接种什么细菌就可以使其不受该病菌感染的免疫接种原理，从而奠定了疫苗的理论基础。因此人们把巴斯德称为疫苗之父。第5页/共120页第五页，共120页。1.2 从疫苗(ymio)生产看生物制品的发展 第二代疫苗亚基疫苗的出现，克服了第一代疫苗潜在致病性的问题。 天然或重组成分为主。 第三代疫苗核酸

4、疫苗，调动细胞免疫和体液免疫两个系统，追求最佳效果。 持久(chji)，广谱，廉价。第6页/共120页第六页，共120页。2 生物制品(shn w zh pn)的分类 1.疫苗等预防类生物制品：细菌类疫苗、病毒类疫苗、类毒素和联合疫苗。 2.抗毒素及免疫血清：由特定抗原免疫动物所得血浆制成的抗毒素或免疫血清，如破伤风抗毒素、抗狂犬病血清等，用于治疗或被动免疫预防。 3.血液制品：如人血白蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子（天然或重组的）、红细胞浓缩物等。 4.诊断(zhndun)制品：包括体内诊断(zhndun)制品和体外诊断(zhndun)制品。第7页/共120页第七页，共120页。3 制造生物

5、制品(shn w zh pn)的生物学及免疫学基础 3.1 生物学基础 A:细菌的代谢(dixi)产物。 (1)热原质 主要是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，注入体内能引起发热反应。 (2)毒素 有内毒素和外毒素两种，均有强烈毒性。 (3)色素 许多细菌能产生色素，对其鉴别有用。第8页/共120页第八页，共120页。 B:外界环境因素对微生物的影响 一方面可创造有利条件，促进它们(t men)的生长繁殖，以制备生物制品；另一方面也可利用对微生物不利的因素使其发生变异或杀灭之，以更好地为制造生物制品服务。 常用的几个概念： 消毒；灭菌；无菌；防腐。第9页/共120页第九页，共120页。3.2 免疫学

6、基础(jch)3.2.1 机体的抗感染免疫 1)先天性免疫（非特异性免疫） 包括(boku)： 体表屏障，如皮肤粘膜屏障； 血脑屏障，防御病原微生物及其毒性产物从血流侵入脑组织； 细胞吞噬作用； 正常体液和组织中的抗菌物质。第10页/共120页第十页，共120页。2)特异性免疫： 个体在生命过程中接受抗原刺激后主动产生或被动获得的。又称获得性免疫。 包括(boku)自动免疫和被动免疫。 自自 然然 自自 动动 免免 疫疫：患患 传传 染染 病病，隐隐 性性 感感 染染自自 动动 免免 疫疫人人 工工 自自 动动 免免 疫疫：接接 种种 疫疫 苗苗，类类 毒毒 素素自自 然然 被被 动动 免免

7、疫疫：经经 胎胎 盘盘，初初 乳乳特特 异异 性性 免免疫疫被被 动动 免免 疫疫人人 工工 被被 动动 免免 疫疫：注注射射抗抗毒毒素素，丙丙种种球球蛋蛋白白，细细胞胞因因子子第11页/共120页第十一页，共120页。人工免疫 人为的给机体输入抗原以调动机体的免疫系统，或直接输入免疫血清，使获得某种特殊抵抗力，用以预防或治疗某些疾病者，称人工免疫。人工主动免疫(artificial active immunization)：是指给机体接种抗原性物质如疫苗，类毒素等，刺激机体免疫系统产生(chnshng)特异性免疫力的方法。3.2.2 人工免疫(rn n min y)第12页/共120页第十二

8、页，共120页。人人 工工 自自 动动 免免 疫疫 和和 人人 工工 被被 动动 免免 疫疫 的的 比比 较较区区 别别 点点人人 工工 自自 动动 免免 疫疫人人 工工 被被 动动 免免 疫疫接接 种种 物物疫疫 苗苗 ， 类类 毒毒 素素抗抗 体体 （ 抗抗 毒毒 素素 ， 丙丙 球球 ）免免 疫疫 出出 现现 时时 间间慢慢 ， 1-4周周快快 ， 立立 即即免免 疫疫 力力 维维 持持 时时 间间长长 （ 数数 月月 -数数 年年 ）较较 短短 （ 2周周 -数数 周周 ）用用 途途主主 要要 用用 于于 预预 防防多多 用用 于于 紧紧 急急 预预 防防 和和 治治 疗疗人工被动免疫

9、 (artificial passive immunization) : 是给人体(rnt)注射含特异性抗体的免疫血清或细胞因子等制剂，使受者迅速获得特异性免疫力的方法。第13页/共120页第十三页，共120页。3.3 人工自动(zdng)免疫类生物制品疫苗（Vaccine）：细菌，病毒(bngd)，螺旋体，立克次体和类毒素等抗原性生物制品统称为疫苗。 安全 有效 实用分类1）死疫苗（death vaccine）:选用免疫原性强的微生物标准株经大量培养后，用物理或化学方法将其杀死或灭活而制成的预防制剂。如霍乱、百日咳、伤寒、钩端螺旋体疫苗。优点：主要诱导特异性抗体产生，安全缺点：不能繁殖，需多

10、次刺激，注射局部和全身反应严重第14页/共120页第十四页，共120页。2）减毒活疫苗（live-attenuated Vaccine） 用人工定向变异或从自然界筛选得到的毒力高度减弱或基本无毒的病原微生物制成的预防制剂。 优点：一次免疫即可获得长久免疫力，类似自然状态(zhungti)下的轻型或隐性感染。诱导体液免疫和细胞免疫。缺点：不易保存，存在回复突变的危险 如卡介苗 牛痘 麻疹等死死疫疫苗苗活活疫疫苗苗制制剂剂性性状状杀杀死死的的病病原原微微生生物物弱弱毒毒或或无无毒毒的的病病原原微微生生物物接接种种量量及及次次数数量量大大，2-3 次次量量小小，1 次次保保存存及及有有效效期期易易保

11、保存存，较较稳稳定定，有有效效期期一一年年不不易易保保存存，4 度度数数周周失失效效免免疫疫效效果果较较差差，维维持持数数月月至至一一年年较较好好，维维持持 1-5 年年或或更更长长第15页/共120页第十五页，共120页。3）类毒素（Toxid） 细菌(xjn)外毒素经0.3-0.4%甲醛处理，使其毒性减弱而保留其免疫原性。 白百破：白喉类毒素+ 百日咳杆菌死疫苗+破伤风类毒素4）新型疫苗（1）亚单位疫苗（Subunit Vaccine） 是去除病原体中与激发保护性免疫无关的甚至有害的成分，保留有效免疫原成分制作的疫苗。优点：免疫效果高， 不良反应少（2）合成肽疫苗 (synthetic p

12、eptide vaccine) 将具有保护性免疫力的人工合成肽与适当载体结合后，再加入佐剂制成的疫苗。 乙肝病毒多肽疫苗第16页/共120页第十六页，共120页。（3）基因工程疫苗DNA 疫苗（DNA Vaccine） 是用编码病原体有效免疫原的基因与细菌质粒构建的重组(zhn z)体直接免疫机体，转染宿主细胞，使其表达保护性抗原，从而诱导机体产生特异性免疫的疫苗。优点：体内可持续表达，免疫效果好，维持时间长。缺点：其机制和安全性尚不完全清楚，一些问题有待解决。重组(zhn z)抗原疫苗(recombinant antigen vaccine) 是利用DNA重组(zhn z)技术制备的只含保护

13、性抗原的纯化疫苗。优点：不含活的病原体和病毒核酸，安全有效，成本低廉。 目前获准使用的有乙型肝炎疫苗。第17页/共120页第十七页，共120页。重组载体疫苗(recombinant vector vaccine) 是将编码病原体有效免疫原的基因插入载体（减毒的病毒或细菌疫苗株）基因组中，接种后，随疫苗株在体内的增殖，大量所需的抗原得以表达。如果将多种病原体的有关基因插入载体，则成为可表达多种保护性抗原的多价疫苗。 载体：痘苗病毒转基因植物疫苗 用转基因方法，将编码有效免疫原的基因导入可食用植物细胞的基因组中，免疫原即可在植物的可食用部分稳定的表达和积累，人类和动物通过摄食达到免疫接种的目的。常

14、用(chn yn)的植物有蕃茄、马铃薯、香蕉等。第18页/共120页第十八页，共120页。（一）特异性免疫治疗剂1）抗毒素 利用类病毒注射动物(dngw)，产生特异性抗体，经采血、分离、纯化后制成的产品。 2）抗病毒血清 用病毒作抗原免疫动物制备的含有(hn yu)抗体的血清生物制品。3.4 人工(rngng)被动免疫类生物制品还有：抗菌血清、免疫球蛋白、免疫核糖核酸等第19页/共120页第十九页，共120页。（二）非特异性免疫(miny)治疗剂-免疫(miny)调节剂1）转移因子2）白细胞介素6）小棒杆菌(gnjn)3）胸腺素4）细胞(xbo)毒T细胞(xbo)5）卡介苗7）干扰素第20页/

15、共120页第二十页，共120页。第二节：疫苗研究及其研制(ynzh)策略 疫苗的现代定义为：一切通过注射或黏膜途径接种，可以(ky)诱导机体产生针对特定致病原的特异性抗体或细胞免疫，从而使机体获得保护或消灭该致病原能力的生物制品统称为疫苗，包括蛋白质、多糖、核酸、活载体或感染因子。 预防用生物制品按所用材料一般分细菌性疫苗、病毒性疫苗及类毒素三大类。第21页/共120页第二十一页，共120页。1 1 接种接种(jizhng)(jizhng)目的及作用目的及作用 接种目的 防止病原体进入机体 建立抗感染免疫 口服或注射疫苗 激发宿主产生(chnshng)抗病原体的抗体 暴露于病原体也不会生病 进

16、入机体的病原体被抗体失活第22页/共120页第二十二页，共120页。2 2 疫苗疫苗(ymio)(ymio)的种类的种类 从疫苗研制技术(jsh)又可将疫苗分为传统疫苗和新型疫苗两大类。 2.1常规疫苗 1）疫苗 （1）活疫苗：减毒活疫苗（卡介苗） （2）死疫苗（百日咳、霍乱等） 2）类毒素 破伤风类毒素、白喉类毒素 3）自身疫苗 由病人自身病灶中分离出的病原体制成的死疫苗。第23页/共120页第二十三页，共120页。2.2 新型(xnxng)疫苗 1）亚单位疫苗 一类保留(boli)病原体中有效免疫原成分，而除去无效成分和有毒成分的化学纯疫苗。 乙肝亚单位疫苗 2）化学疫苗 用化学方法提取病

17、原体中有效免疫原成分体制成的化学纯疫苗，比亚单位疫苗更为简单。 肺炎链球菌荚膜多糖 3）多肽疫苗 人工合成的高免疫原性多肽片段制成的疫苗。 乙型肝炎表面抗原的各种合成肽段第24页/共120页第二十四页，共120页。 4）基因工程疫苗 利用(lyng)基因工程构建重组基因序列，表达免疫原性强、无毒性的多肽制成的疫苗。 乙型肝炎基因工程疫苗 5）DNA疫苗 用编码抗原基因制成的疫苗。 流感病毒核蛋白DNA疫苗 通常也习惯地将遗传重组疫苗、合成肽疫苗和抗独特型抗体疫苗包括在新型疫苗范畴。 第25页/共120页第二十五页，共120页。3 3 疫苗疫苗(ymio)(ymio)的基本成分、性质和特征的基本

18、成分、性质和特征 3.1 疫苗的基本成分 疫苗的基本成分包括抗原、佐剂、防腐剂、稳定剂、灭活剂及其他活性成分。 抗原，是疫苗最主要的有效活性成分，它决定了疫苗的特异免疫原性。构成(guchng)抗原的三个基本条件：异物性、特异性和一定的理化特性。第26页/共120页第二十六页，共120页。 可用作抗原的生物活性物质有：灭活病毒或细菌、活病毒或细菌通过实验室多次传代得到的减毒株、病毒或菌体提纯物、有效蛋白成分、类毒素、细菌多糖、合成多肽以及近年来发展DNA疫苗所用的核酸等。 佐剂，能增强抗原的特异性免疫(miny)应答。目前常用的有铝佐剂和油制佐剂。第27页/共120页第二十七页，共120页。

19、3.2 疫苗的基本性质 包括免疫原性、安全性、稳定性。 免疫原性：指疫苗接种进入机体后引起机体产生免疫应答的强度和持续时间。 影响(yngxing)的因素包括机体的因素和疫苗的因素。从疫苗的角度看是由疫苗的抗原决定的。包括抗原的强弱、大小和稳定性以及抗原的理化性质。第28页/共120页第二十八页，共120页。4 4 疫苗制备疫苗制备(zhbi)(zhbi)的基本过程的基本过程 疫苗因种类不同，其制备方法也不相同，但总的来说，经典疫苗制备的基本过程包括：选择适宜的培养基或细胞，进行菌、毒株大量繁殖，收集(shuj)培养物，提纯，半成品检定，稀释，分装，成品检定。 基因工程技术使疫苗研制方法发生了

20、革命性的变化。第29页/共120页第二十九页，共120页。5 5 疫苗疫苗(ymio)(ymio)的研制策略的研制策略当代(dngdi)疫苗灭活疫苗杀死的病原体减活疫苗活的，无毒力的病原体第30页/共120页第三十页，共120页。生产(shngchn)过程u组织培养病原体u纯化病原体u失活或减活u并没失去激发(jf)免疫的能力第31页/共120页第三十一页，共120页。局限性u不是所有的病原体都能用组织培养u细胞培养价格昂贵u产量(chnling)、生产率低u需要特殊的安全预防措施u失活或减活都必须100u保存期限短，需低温保藏u不能预防所有的疾病第32页/共120页第三十二页，共120页。r

21、DNA技术对疫苗(ymio)研究的促进u减活疫苗通过清除致病基因实现u基因工程疫苗，无致病性载体携带(xidi)致病病原体的抗原性决定簇u非组织培养，克隆基因和过量表达蛋白作为疫苗（亚单位疫苗）第33页/共120页第三十三页，共120页。多种基因工程疫苗研制(ynzh)策略u亚单位(dnwi)疫苗u肽疫苗u减活疫苗uDNA疫苗第34页/共120页第三十四页，共120页。5.1 亚单位(dnwi)疫苗u通常是整个病原体制备减活或灭活疫苗u免疫反应(fnyng)的激发通常是通过病原体的外u 壳蛋白起作用第35页/共120页第三十五页，共120页。动物(dngw)病毒 ？是不是需要(xyo)完整的病

22、原体第36页/共120页第三十六页，共120页。亚单位(dnwi)疫苗u激发免疫反应仅仅需要病原体外壳蛋白u利用病原体的某些(mu xi)成分而不是整个病原体是“亚基”疫苗。第37页/共120页第三十七页，共120页。亚单位(dnwi)疫苗u优点u 采用纯化蛋白保证疫苗安全性和稳定性u缺点u 纯化成本(chngbn)高u 分离的蛋白不具有与病原体相同的构象，因此可能没有相应的抗原性第38页/共120页第三十八页，共120页。u单纯疱疹病毒（HSV）u 性传播疾病u 潜在致癌性u 脑炎和严重的眼部感染u亚单位(dnwi)疫苗可能是最有效的u 减活或失活率必须是100，否则，人群有感染危险亚单位(

23、dnwi)疫苗（example）第39页/共120页第三十九页，共120页。亚单位(dnwi)疫苗（example）uHSVu 抗原(kngyun)靶位是哪里？u HSV外膜糖蛋白gD第40页/共120页第四十页，共120页。HSV gD第41页/共120页第四十一页，共120页。HSV gD糖蛋白疫苗(ymio)u分离基因( jyn)u克隆表达u纯化表达的蛋白u膜蛋白难以纯化分离u 变异，去除膜绑定第42页/共120页第四十二页，共120页。变异(biny)修饰后的HSV糖蛋白第43页/共120页第四十三页，共120页。HSV gD糖蛋白疫苗(ymio)u亚单位疫苗生产u 克隆表达u 大量表

24、达u 纯化(chn hu)u实验室中对HSV-1和HSV-2均有效 u临床试验中低效第44页/共120页第四十四页，共120页。5.2 肽疫苗(ymio)u亚单位疫苗采用完整的蛋白u包含(bohn)多个抗原决定簇u肽疫苗u某个抗原蛋白上的某一区域 u单一的抗原决定簇或者表位 第45页/共120页第四十五页，共120页。含表面抗原的膜绑定蛋白(dnbi)第46页/共120页第四十六页，共120页。肽疫苗(ymio)u需要与其它(qt)分子相连接避免迅速降解u乙肝核心抗原（HBcAg）u高免疫原性载体蛋白u自装配成颗粒第47页/共120页第四十七页，共120页。肽疫苗(ymio)结构第48页/共1

25、20页第四十八页，共120页。肽疫苗(ymio)局限u表位必须由相邻的氨基酸组成u并非所有的肽都能激发免疫反应（可能需要2个或者更多）u肽必须含有与其(yq)在病原体内相同的构象u激发有效免疫所需肽疫苗的数量可能是失活病原体的1000倍第49页/共120页第四十九页，共120页。5.3 减活疫苗（Attenuated）u减活疫苗u通常更有效(yuxio)（较前两种疫苗）u但不能含有任何毒力第50页/共120页第五十页，共120页。减活疫苗新的减活疫苗rDNA 技术(jsh)提供遗传改造(gizo)手段第51页/共120页第五十一页，共120页。病原体修饰(xish)制备减活疫苗u无致病能力的病

26、原体做载体，携带和表达来自靶病原体的抗原决定簇u致病性病原体被修饰，改造或去除(q ch)致病基因第52页/共120页第五十二页，共120页。减活疫苗优势(yush)u仅病原体的抗原决定簇被克隆进入非致病性病原体载体，无致病可能u致病基因的消除(xioch)大大降低病原体毒力恢复的可能性u完整的病原体比亚单位疫苗和肽疫苗有更强的免疫原性第53页/共120页第五十三页，共120页。霍乱(hulun)疫苗的设计（example）u霍乱(hulun)u病原体是霍乱(hulun)弧菌u典型病症（发烧，腹泻，脱水）u通过污染的饮用水传染第54页/共120页第五十四页，共120页。霍乱(hulun)疫苗的

27、设计u霍乱u分泌肠毒素到小肠u5个B亚基 受体u1个A亚基 毒素u区域A1 毒性(d xn)活性区u区域A2 与B亚基相连第55页/共120页第五十五页，共120页。霍乱疫苗(ymio)设计u毒性区域A1u疫苗靶位u去掉A1区，将病原体移回细菌，产生(chnshng)无致病性的霍乱疫苗第56页/共120页第五十六页，共120页。基因(jyn)敲除策略第57页/共120页第五十七页，共120页。基因(jyn)敲除策略第58页/共120页第五十八页，共120页。基因(jyn)敲除策略第59页/共120页第五十九页，共120页。6 疫苗(ymio)的发展前景 治疗性疫苗 大剂量高度纯化的微生物抗原和

28、能提高(t go)免疫功能的其他组分组合而成的治疗性疫苗，抗原量大，免疫原性强，对免疫系统有较强的刺激作用，而且疫苗通过不同的途径把微生物抗原递呈给免疫系统，能更有效地诱导免疫应答，且可消除免疫耐受。 第60页/共120页第六十页，共120页。6 疫苗(ymio)的发展前景 目前，已有治疗性疫苗治疗麻风、慢支、疱疹病毒感染、爱滋病和乙肝等疾病的临床试验报告。肿瘤(zhngli)疫苗也是研究的热点之一。 通过食物摄取的疫苗和个性化疫苗。 多价联合疫苗。第61页/共120页第六十一页，共120页。第十三章 生物制品(shn w zh pn)（之二）第62页/共120页第六十二页，共120页。 一、

29、生物制品概述 二、疫苗研究及其研制策略 三、生物制品的质量要求与检定( jindng) 四、生物制品的一般制造方法 五、重要生物制品的制备 六、核酸疫苗第63页/共120页第六十三页，共120页。第三节 生物制品(shn w zh pn)质量要求与检定 生物制品质量的特殊重要性 所有预防制品都是直接用于大量健康(jinkng)人群（儿童） 所用治疗制品都是通过非胃肠途径直接用于患者 诊断试剂，其质量则关系到能否对患者或试样做出特异、敏感的正确诊断和分析 生物制品的质量 安全性 有效性 可接受性第64页/共120页第六十四页，共120页。 生物制品的GMP管理药品生产质量管理规范 GMP（Goo

30、d Manufacturing Practices for Drugs）：是对生物制品生产全过程的质量管理，涉及人员、厂房和设备、原料采购入库、检验、发料，加工，在制品及半成品检验，分包装，成品检定，出品销售，运输，用户意见及使用(shyng)反应处理等在内的全过程的质量管理。 主要包括以下三个方面：人员、厂房和设备和原材料（硬件）、管理制度和要求（软件） 第65页/共120页第六十五页，共120页。 3.1 生物制品的标准(biozhn)化 3.1.1 生物制品规程 3.1.2 标准(biozhn)品 3.1.3 实验动物 3.2 生物制品的质量检定 3.2.1 生物制品的理化检定 3.2.

31、2 生物制品的安全检定 3.2.3 生物制品的效力检定第66页/共120页第六十六页，共120页。 3.1.1 生物制品规程 中国生物制品规程是我国生物制品生产(shngchn)、检定、经营和使用的技术法规，是监督检 验生物制品质量的法定标准。 3.1 生物制品(shn w zh pn)的标准化第67页/共120页第六十七页，共120页。3.1 生物制品(shn w zh pn)的标准化 3.1.2 生物制品标准物质 定义：系指用于生物制品效价、活性或含量测定的或其特性鉴别、检查的生物标准品或生物参考物质。 国际标准品，由WHO制备(zhbi)、审定和分发 国家生物标准品，由国家鉴定机构制备(

32、zhbi)、审定和分发种类：国际(guj)标准品国际(guj)参考品国际(guj)生物参考试剂种类：v国家生物标准品v国家生物参考品v国家生物参考试剂第68页/共120页第六十八页，共120页。第69页/共120页第六十九页，共120页。第70页/共120页第七十页，共120页。 3.1.2 生物制品标准(biozhn)物质 标准(biozhn)物质的审批 检定所组织检定 卫生部生物制品标准(biozhn)化委员会审查 卫生部审批 发放比准证书 标签及说明书 标准(biozhn)物质的索取与保管3.1 生物制品(shn w zh pn)的标准化第71页/共120页第七十一页，共120页。第72

33、页/共120页第七十二页，共120页。第73页/共120页第七十三页，共120页。3.2 生物制品(shn w zh pn)的质量检定 3.2.1 生物制品的理化检定 3.2.2 生物制品的安全(nqun)检定 3.2.3 生物制品的效力检定第74页/共120页第七十四页，共120页。3.2 生物制品的质量(zhling)检定 3.2.1 生物制品的理化检定 参照生物制品化学检定规程(guchng) 物理性状检查 蛋白质含量测定 防腐剂含量测定 纯度检查 其它外观真空度及溶解(rngji)时间半微量定氮法酚试剂法紫外吸收法苯酚含量测定汞类防腐剂含量测定氯仿含量测定游离甲醛含量测定区带电泳免疫电

34、泳凝胶层析水份含量测定氢氧化铝与磷酸铝含量测定磷含量测定O-乙酰基含量测定第75页/共120页第七十五页，共120页。 3.2.2 生物制品的安全检定 一般安全性检查(jinch) 杀菌、灭活和脱毒情况的检查(jinch) 外源性污染检查(jinch) 过敏性物质检查(jinch)3.2 生物制品的质量(zhling)检定第76页/共120页第七十六页，共120页。第77页/共120页第七十七页，共120页。 杀菌(sh jn)、灭活和脱毒情况的检查 活毒检查 灭活疫苗 解毒检查 类毒素 残余毒力实验 活疫苗3.2 生物制品(shn w zh pn)的质量检定第78页/共120页第七十八页，共

35、120页。残余毒力和毒性物质检查过敏性物质的检查3.2.3 生物制品的效力检定免疫力试验活菌数和活病毒滴度测定类毒素和抗毒素的单位测定血清学实验(shyn)其他有关效力的检定和评价第79页/共120页第七十九页，共120页。第四节：生物制品的一般制造(zhzo)方法4.1 病毒类疫苗制造方法 疫苗制备(zhbi)工艺各异，但主要程序一致。第80页/共120页第八十页，共120页。疫苗(ymio)制备工艺流程第81页/共120页第八十一页，共120页。4.1.1毒种的选择(xunz)和减毒毒株必须(bx)满足的条件抗原性典型形态，感染特定组织人工繁殖，不产生毒素无毒力回复不被病毒感染第82页/共

36、120页第八十二页，共120页。4.1.2 病毒(bngd)繁殖 （1）活体动物(dngw)培养：牛痘 牛皮下，乙脑 鼠脑等。生产中已淘汰。 （2）鸡胚培养。较动物(dngw)管理方便。易受支 原体，沙门菌污染。 （3）组织培养。广泛用于病毒培养。 （4）细胞培养。第83页/共120页第八十三页，共120页。培养细胞的生长方式(fngsh)及类型 贴附生长型细胞 为能附着于底物（支持物）表面生长的细胞。包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞都属于这一类型。当这类细胞从活体体内转移到体外培养(piyng)时，必须贴附于底物才能生长。从形态上大体分为上皮细胞型和成纤维细胞型。VEGF929兔肾

37、原代细胞第84页/共120页第八十四页，共120页。 悬浮生长型细胞 少数细胞类型在体外培养是不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长，来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞均属于这一类型。这些细胞在悬浮培养中生长良好，可以是单个细胞或细小的细胞团，细胞呈圆形。细胞悬浮生长于培养基中，细胞生长空间(kngjin)大，具有能够提供增殖大量细胞、传代方便、易于收获的优点。SP20第85页/共120页第八十五页，共120页。维持细胞培养所需的最佳条件 在大规模培养动物细胞的过程中，最根本的是使细胞的培养条件达到最优化，尽可能消除或减轻环境对细胞的影响，维持细胞高存活力

38、和高效表达，同时又要充分考虑细胞表达产物(chnw)的后续纯化。第86页/共120页第八十六页，共120页。配制细胞生长最适合的培养基 常用(chn yn)维持液和生长液 Eagle、RPM1640,DEME等作为维持液，加入牛血清为生长液。细胞培养环境 影响细胞培养的主要因素有:CO2、溶氧(DO)、温度、pH值、葡萄糖、氨、乳酸、甲基乙二醛(MG)、培养基成分等。第87页/共120页第八十七页，共120页。 细胞培养环境 最适CO2水平为4%10%， 溶氧维持在20%50%， 温度大多数在37， pH值在7.07.4之间。 控制细菌污染，加入青霉素、链霉素 培养时间24天。 葡萄糖是细胞培

39、养过程中主要(zhyo)的能量来源，必须维持在一定水平。第88页/共120页第八十八页，共120页。4.1.3 疫苗的灭活原则：充分破坏疫苗的毒力，尽量减少疫苗免疫力损失。0.20.4的甲醛或酚溶液。4.1.4 疫苗的纯化去除存在的动物组织，降低接种不良反应。4.1.5 冻干(dn n) 升华，不使疫苗融解。疫苗稳定性提高1倍以上。第89页/共120页第八十九页，共120页。4.2 细菌类疫苗和类毒素的一般(ybn)制造方法 细菌类疫苗(ymio)和类毒素均由细菌培养开始， 制备的主要程序相似。 细菌类疫苗(ymio)对菌体进一步加工 类毒素对细菌分泌的外毒素加工第90页/共120页第九十页，

40、共120页。疫苗和类毒素制备(zhbi)工艺流程第91页/共120页第九十一页，共120页。4.2.1 菌种的选择(xunz)抗原性典型形态，培养特性和理化特性易于在人工培养基上培养，不产生(chnshng)毒素培养过程中毒性小或无毒力回复制备毒素时泽培养过程中产生(chnshng)大量的典型毒素第92页/共120页第九十二页，共120页。4.2.2培养基的营养要求碳、氮源和无机盐等必需外，有时(yush)需添加生长因子。结核杆菌以甘油为碳源，百日咳杆菌需要谷氨酸，胱氨酸为氮源。4.2.3 培养条件控制 氧分压、温度、pH、避光4.2.4 杀菌彻底杀死细菌不影响防病效力4.2.5 稀释、分装和

41、冻干含防腐剂的NS稀释，无菌分装。第93页/共120页第九十三页，共120页。4.3 生物制品(shn w zh pn)的分包装 4.3.1 分装 分装前，检定合格，标签完整，明确。 防止错批，混批。 无菌操作，实际装量多于标签示量。 4.3.2 包装 破漏检查。 载名名称(mngchng)、批号、亚批号、有效期等。第94页/共120页第九十四页，共120页。第五节 重要生物制品(shn w zh pn)的制备 乙型肝炎疫苗的制备 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）属嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae）。 HBV的发现源于表面抗原的研究。 1963年Blum

42、berg首先在澳大利亚土著人血清中发现一种新抗原，称为澳大利亚抗原（Australia antigen）；直至1968年确定这种抗原与血清型肝炎密切相关，称为肝炎相关抗原（hepatitis associated antigen，HAA）；1970年D.S. Dane在肝炎患者血清中发现具有传染性的颗粒，即Dane颗粒（Danes particle）。从而HBV被确认。 HBV是乙型肝炎病原体，主要经输血(sh xu)、注射、性行为和母婴传播。起病徐缓，部分患者可转为慢性，少数还可导致肝硬化和肝癌。第95页/共120页第九十五页，共120页。乙肝病毒发病(f bng)区域第96页/共120页第

43、九十六页，共120页。乙型肝炎病毒(bngd)形态与结构 完整的HBV颗粒亦称Dane颗粒，直径为42nm，具有双层核壳结构：核心颗粒：直径为28nm。 颗粒内部(nib)：DNA和DNA多聚酶。 颗粒表面（内衣壳）：含有HBcAg 和HBeAg 。外壳（包膜）：厚7nm。 脂质双层：含有HBsAg、PHSAr 和PreSAg蛋白质第97页/共120页第九十七页，共120页。乙肝病毒传染(chunrn)途径第98页/共120页第九十八页，共120页。乙肝病毒检测(jin c)第99页/共120页第九十九页，共120页。HBV感染血清(xuqng)标志及其临床意义HBsAgHBeAg抗HBc 抗

44、HBe抗HBs结 果 解 释IgMIgG-+感染过HBV或接种过乙肝疫苗,有免疫力+-/+-肝功正常为无症状携带者;肝功异常为正患乙肝;+-+-（小三阳）正患乙肝,肝炎趋向好转，有传染性+/-+-正患肝炎,或趋于恢复，有传染性+/-（大三阳）正患乙肝,病毒复制,传染性强-+/-+乙型肝炎恢复期第100页/共120页第一百页，共120页。乙肝疫苗的制备(zhbi)血源疫苗 特点: (1)血源取得困难; (2)疫苗(ymio)需经安全试验,故费用大,生产周期达65周. (3)现已淘汰。第101页/共120页第一百零一页，共120页。乙肝疫苗的制备人工合成(rn n h chn)多肽疫苗 工艺过程:

45、人工合成HBsAg的P25多肽,并在124与137位半胱氨酸残基之间引入-S-S-,使成环状多肽,用其免疫动物后,50%出现抗体应答。 特点:纯净,不会污染其他病毒,无传染性,原材料来源(liyun)方便,但目前生产成本高,难以大量生产。第102页/共120页第一百零二页，共120页。乙肝疫苗的制备(zhbi)基因工程疫苗工艺路线:(1) 将HBV的DNA片段插入到质粒并引入到E.coli中,使其复制表达抗原物质。(2) 将HBV的DNA片段插入到牛痘病毒,再由此病毒重组体感染细胞,可分泌HBsAg。(3)用一含HbsAg的质粒转化中国仓鼠(cn sh)卵巢细胞(CHO),在该细胞中表达Hbs

46、Ag蛋白,释放于培养液中,从培养液中提纯抗原蛋白。第103页/共120页第一百零三页，共120页。 曾研究过用真核和原核细胞作为表达宿主，包括哺乳动物细胞、植物细胞、酵母、细菌和病毒(bngd)等。 目前大规模生产的表达系统有酿酒酵母、毕赤酵母和汉逊酵母等基因工程疫苗，其次为CHO细胞基因工程疫苗，还有HBsAg+PreS2或HBsAg+PreS1+ PreS2（CHO细胞和酵母表达系统）。第104页/共120页第一百零四页，共120页。第六节 核酸(h sun)疫苗6.1 概念它是利用基因重组技术直接将编码某种抗原蛋白(dnbi)的外源基因（DNA）与质粒重组后，直接导入动物细胞内，并通过宿

47、主细胞的转录系统合成抗原蛋白(dnbi)，诱导宿主产生对该抗原蛋白(dnbi)的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。第105页/共120页第一百零五页，共120页。6.2 发展(fzhn)历史 1990年Wolff等偶然发现给小鼠肌肉注射外源性重组质粒后，质粒被摄取并能在体内至少两个月稳定地表达所编码蛋白。 1991年Willams等发现外源基因输入体内的表达产物可诱导产生免疫应答。 1992年Tang等将表达人生长激素的基因质粒DNA导入小鼠皮内，小鼠产生特异性抗体，从而提出了基因免疫的概念。 1993年Ulmer等证实小鼠肌肉注射含有编码甲型流感病毒核蛋白（NP）的重组质粒后，可有效地保

48、护小鼠抗不同亚型、分离时间相隔34年的流感病毒的攻击。随后的大量动物实验都说明在合适的条件下，DNA接种后既能产生细胞免疫又能引起体液(ty)免疫。 1994年在日内瓦召开的专题会议上将这种疫苗定名为核酸疫苗。核酸疫苗的出现与发展是疫苗发展史上的第三次革命。第106页/共120页第一百零六页，共120页。6.3 DNA疫苗表达(biod)抗原VIII III IV12gene(DNA)RNAantigen(protein)u基因指导其编码抗原的产生u抗原激活免疫(miny)反应u产生抗体u细胞免疫(miny)第107页/共120页第一百零七页，共120页。6.4 DNA疫苗(ymio)用于基因治疗ex vivoin vivo1) purification of target cells2) gene transfer3) re-infusion of modified